董晓茜，陈 贺，戚哲源，朱婉玲，张振秋*



苦芪滴丸中氧化槐果碱在大鼠血浆中的药代动力学研究

董晓茜1，陈 贺1，戚哲源1，朱婉玲2，张振秋2*

目的 建立测定血浆中氧化槐果碱浓度的高效液相色谱法，并用此方法进行苦芪滴丸中氧化槐果碱的药代动力学研究。方法色谱柱为Inertsil-NH2(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙腈-无水乙醇-3%磷酸水(86∶8∶6)；流速：1.0 mL/min；检测波长：220 nm；进样量：20 μL。结果血浆中氧化槐果碱的线性范围：0.20～20 μg/mL，r=0.993，最低检测限为0.20 μg/mL。日内、日间精密度及准确度、提取回收率符合要求。6只大鼠灌胃给药8.5 mg/kg苦芪滴丸后，血浆中氧化槐果碱Tmax为(4.03±0.72)h，Cmax为(4.00±0.54)ng/mL，t1/2为(0.05±0.66)h，采用梯形法计算，AUC0-t为(30.70±0.54)μg·h/mL，AUC0-∞为(30.8±0.32)ng·h/mL。结论本方法简便、快速、准确、专属性强，可用于苦芪滴丸中氧化槐果碱的药代动力学研究。

高效液相色谱；黄芪；苦参；氧化槐果碱；药代动力学

0 引言

中药药对是中医辨证论治理论精髓的具体体现，处方或配伍的细微变化往往表现出药效和适应证的显著差异。近几年，对组成较小或较简单的复方-药对的研究较多，但大多是在化学成分的含量和变化、药理作用等方面，对药对在动物体内的药物代谢动力学的研究还较少。

苦芪滴丸是黄芪和苦参药材以1∶2配比经醇提后制得，主要含皂苷类和生物碱类物质。两药配伍，药味虽少，却寒热并用，补泻同施，升降相随，共奏健脾益气，清心解毒之功。适用于病毒性心肌炎气虚湿毒内侵之虚实夹杂证。氧化槐果碱是苦芪滴丸的主要功效成分之一，本文采用高效液相色谱法测定6只大鼠给药后血浆中氧化槐果碱的浓度，考察了方法的线性范围、精密度、准确度、回收率和稳定性等效能指标。血浆样品处理采用液-液萃取，考察了提取回收率，并计算药物动力学参数。

1 仪器与试剂

1.1 仪器与设备 日本岛津N2000高效液相色谱系统(配有一元泵，可变波长紫外检测器，脱气机，柱温箱和N2000工作站)；电子分析天平，傲豪斯公司；TGL-16C高速离心机，海安亭科学仪器厂；微量移液器，上海求精玻璃仪器厂；WX-80A微型旋涡混合仪，上海沪西分析仪器厂；FJ-200高速分散均质机，上海标本模型厂。

1.2 药品与试剂 黄芪、苦参药材均购自河北安国，经辽宁中医药大学药学院王冰教授鉴定黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hisao的干燥根，苦参为豆科植物苦参SophoraflavescensAit.的干燥根；氧化槐果碱对照品(批号：111652-200301)和士的宁(批号：0705-200306)对照品，均购自中国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈及无水乙醇均为色谱纯，购自天津凯信化学工业有限公司；磷酸、氯仿均为分析纯，购自华北地区特种化学试剂开发中心(天津)。

1.3 实验动物 健康Wistar大鼠，雌雄各半，体重200～250 g，由大连医科大学实验动物中心提供。

2 血浆中氧化槐果碱分析方法

2.1 色谱条件 分析柱：Inertsil-NH2(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙腈-无水乙醇-3%磷酸水(86∶8∶6)；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；柱温：35 ℃；检测波长：220 nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品系列浓度溶液 精密称取氧化槐果碱适量，用甲醇溶解制成1.00 mg/mL的储备液。分别精密量取储备液适量，用甲醇逐级稀释成浓度为2.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL的标准系列溶液，置4 ℃冰箱中保存。

2.2.2 内标溶液 精密称取士的宁适量，用甲醇溶解制成245 μg/mL的储备液。取0.5 mL内标储备液至50 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成2.5 μg/mL的内标溶液，置4 ℃冰箱中保存。

2.3 血浆样品的处理 取血浆500 μL，加入内标溶液50 μL，涡旋混合1 min，加水饱和碳酸钠100 μL，涡旋混合1 min，加乙腈200 μL，涡旋混合1 min，加氯仿1.3 mL，涡旋混合5 min，离心(3 000 r/min)5 min，取下层有机相置另一试管中，空气流下(40 ℃)吹干，残渣加流动相50 μL溶解，进样20 μL。

2.4 分析方法考察

2.4.1 方法的专属性 血浆样品测定色谱图表明，空白血浆样品中内源性物质不干扰氧化槐果碱的测定，空白样品添加标准品色谱图表明，氧化槐果碱色谱峰tR为17.5 min，内标士的宁tR为10.7 min，如图1所示。

图1 方法专属性试验色谱图

2.4.2 标准曲线与线性范围 取大鼠空白血浆500 μL，各加入氧化槐果碱标准系列溶液50 μL，制成相当于氧化槐果碱浓度为0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL的模拟血浆样品，按“血浆样品的分析方法”操作，每一浓度进行3样本分析，进样20 μL，记录色谱图。以待测物浓度为横坐标、待测物与内标物峰面积比值为纵坐标，用加权(w=1/χ2)最小二乘法进行回归分析，求得直线回归方程即为标准曲线。回归方程：A=0.589 C+0.089 8，r=0.976 4

2.4.3 方法精密度与准确度 取空白血浆500 μL，按“2.4.2”项下的方法制成低、高两个浓度(氧化槐果碱浓度分别为0.5、16.0 μg/mL)的质量控制(QC)样品，每一浓度进行6样本分析，连续测定3 d，根据当日标准曲线计算QC样品测得浓度，根据QC样品测定结果计算本法的精密度与准确度。氧化槐果碱在低、高浓度的日间RSD分别为6.38%、4.7%，日内RSD分别为6.43%、4.39%，回收率分别为101.3%、90.9%。

2.4.4 提取回收率和溶液稳定性 取空白血浆500 μL，按“2.4.2”项下方法制备低、高两个浓度(氧化槐果碱浓度分别为0.5、16.0 μg/mL)模拟血浆样品，每一浓度进行6样本分析，并与配制的相应浓度未被处理溶液比较，以每一浓度两种处理方法峰面积比值计算本方法提取回收率。内标物(0.024 5 mg/mL)提取回收率试验方法相同。见表1。

表1 氧化槐果碱和内标物(士的宁)的提取回收率

取空白血浆500 μL，按“2.4.2”项下方法制备氧化槐果碱低、高两个浓度QC样品(每浓度3样本分析)，在室温下于不同时间测定。结果表明，处理后的氧化槐果碱样品溶液在室温放置12 h内稳定。取空白血浆500 μL，按“2.4.2”项下方法制备氧化槐果碱低、高两个浓度QC样品(每浓度3样本分析)，冻融2循环稳定性考察。见表2。

表2 模拟血浆样品室温放置12 h及冻融2循环稳定性考察结果(μg/mL)

2.4.5 未知样品的测定与质量控制 未知血浆样品测定时，每天建立一条标准曲线，随行测定低、高连个浓度(双样本)QC样品。根据当日标准曲线，计算QC样品和未知样品的浓度，当QC样品RSD≤15%时，当日数据方可接受。

2.5 大鼠药物动力学研究 取健康雌、雄大鼠各3只，随机分为2组。实验前禁食24 h，自由饮水，取空白血0.5 mL后，按8.5 mg/kg大鼠体重灌胃给予苦芪滴丸(相当于氧化槐果碱含量14.5 mg/g)，于0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、12、24 h眼眶取血0.5 mL，置于预先肝素化的离心管中，离心5 min(10 000 r/min)，得血浆。

3 结果

对6只健康Wistar大鼠给予灌胃氧化槐果碱0.014 5 mg/kg，之后采用HPLC法测定6只健康Wistar大鼠灌胃给药后的血浆药物浓度，根据血药浓度-时间数据，计算主要药物动力学参数，见表3，药时曲线见图2。

表3 6只健康Wistar大鼠灌胃给药后的药动学参数

图2 6只大鼠灌胃给药后的平均血药浓度-时间曲线

4 讨论

4.1 流动相的影响 本文采用士的宁做内标，在方法的建立过程中，考察了不同流动相配比对峰形和分离度的影响[1-3]。曾采用乙腈-0.1%甲酸、甲醇-乙腈-水-磷酸、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-无水乙醇-磷酸溶液为流动相，结果乙腈-无水乙醇-磷酸溶液为流动相时分离效果较好。但试验中发现，磷酸溶液的酸度对分离效果有较大影响。因此试用了各种配比的乙腈-无水乙醇-磷酸溶液，最终确定用乙腈-无水乙醇-3%磷酸水溶液(86∶8∶6)作为流动相。

4.2 碱化试剂的选择 本文考察了用强碱进行碱化，提取回收率低。经试验发现，水饱和碳酸钠碱化后提取回收率最高，使用其他碱提取回收率有所降低，因此最终选择用水饱和碳酸钠碱化。

4.3 提取剂的选择 本文参照文献考察了乙醚-氯仿和乙腈-氯仿对氧化槐果碱样品提取的影响[4-6],发现样品在乙腈-氯仿中的溶解度大于在乙醚-氯仿中的溶解度，用乙腈-氯仿作为提取剂提取回收率高于用乙醚-氯仿作为提取剂的提取回收率，所以选择乙腈-氯仿作为提取剂。

[1] 冷晓红，陈海燕，郭鸿雁，等.不同提取方法对苦豆子中氧化槐果碱与槐果碱含量的影响[J].西北药学杂志,2013,28(5):457-458.

[2] 吕佳,王丹,张振秋,等.HPLC同时测定苦参药材中5种生物碱含量[J].中国中医药信息杂志,2013,29(9):61-62.

[3] 蔡凡,张芳向,邹振红,等.HPLC法同时测定三物黄芩汤中苦参碱、氧化苦参碱和氧化槐果碱[J].航空航天医学杂志,2012,23(11):1333-1334.

[4] 张蕾,王志伟,廉建伟，等.HPLC-MS法同时测定大鼠血浆中苦参碱、氧化苦参碱和氧化槐果碱的浓度及其药代动力学[J].药学学报,2008,43(8):843-847.

[5] 路洪,黄圣凯,王晓洪，等.血浆中氧化槐果碱的气相色谱测定及其在兔体内的药代动力学[J].中国药科大学学报,1991,22(1):36-38.

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Pharmacokinetic study on oxymatrine in Kuqi drop pills in rat′s plasma

DONG Xiao-qian1,CHEN He1,QI Zhe-yuan1,ZHU Wan-ling2,ZHANG Zhen-qiu2*

(1.Laboratory of Clinical Pharmacy，Academy of Traditional Chinese Medicine of Liaoning Province，Shenyang 110034，China; 2.College of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China)

Objective To establish an HPLC method for the determination of oxysophocarpin in rat plasma,and study the pharmacokinetics of oxysophocarpin in Kuqi drop pills.MethodsThe analytical column was Inertsil-NH2(150 mm×4.6 mm,5 μm); mobile phase: acetonitrile-ethanol-3% phosphoric acid water (86∶8∶6); flow rate: 1.0 mL/min; detection wavelength: 220 nm; injection volume: 20 μL.ResultsThe linear concentration range of plasma oxysophocarpin was 0.20～20 μg/mL,r=0.993,the lower limits of quantificati were 0.20 μg/mL.The intra-day and inter-day precision,accuracy,extraction recoveries met the requirement.Six rats were fed by gavage administration of 8.5 mg/kg Kuqi drop pills,the plasma oxysophocarpin Tmaxwas (4.03±0.72)h,Cmaxwas (4.00±0.54)ng/mL,t1/2was (0.053±0.66)h,AUC0-twas (30.70±0.54)μg·h/mL,AUC0-∞was (30.8±0.32)ng·h/mL.ConclusionThe method is simple,rapid,accurate,specific,it can be used for the pharmacokinetic study of oxysophocarpin in Kuqi drop pills.

HPLC; Radix astragali; Radix flavescentis ait; Oxysophocarpin; Pharmacokinetics

2014-09-29

1.辽宁省中医药研究院，沈阳 110034；2.辽宁中医药大学药学院，大连 116600

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201505021