■ 郑玉忠 刘亚群 刘 昂 杨培奎 查广才 庄东红， 张振霞

(1.韩山师范学院生物系，广东潮州 521041；2.汕头大学广东省海洋生物技术重点实验室，广东汕头 515063）

凡纳滨对虾（Penaeus vannamei），亦称南美白对虾，是国际公认高养殖、高产量的三大优良虾种（凡纳滨对虾、斑节对虾和中国对虾）之一。凡纳滨对虾抗病力强、耐盐性广、适应能力强、生长快、产肉率高，是世界水产市场的热销品种，1988年引入我国后迅速掀起养殖热潮，目前的凡纳滨对虾产量占全国对虾产量的80%以上。

随着凡纳滨对虾养殖规模的迅速扩张，高密度的养殖、种质的退化和环境污染的加剧等不利因素诱发了大规模的病害；因此，抗生素等药物被普遍用在对虾病害的防治中。但是抗生素的滥用，导致病原物产生抗药性，甚至产生新型病害，进而导致对虾遭受更严重的病害或种质衰退。同时，抗生素在对虾体内的残留又会造成食品安全问题，影响人的健康。

对虾原代细胞培养是研究对虾病害的致病机理、诊断和防控技术的重要手段。肝胰脏恰恰是对虾最为关键和核心的器官，参与消化、吸收、储存、代谢等重要生理活动，特别在启动对虾免疫反应中起重要作用。如能建立肝胰脏细胞培养条件，培养能够继代的肝胰脏原代细胞，将有利于构建对虾病害研究和药物筛选体系。尽管国内外不少专家学者在对虾细胞的体外培养上进行了大量的探索和研究，但目前对虾的细胞培养仍然处于原代培养水平，永生性的细胞性一直未建立。因此，本研究拟用改进的对虾细胞培养技术，对凡纳滨对虾肝胰脏细胞进行优化，提高肝胰脏细胞存活率，建立和完善成熟高效的对虾原代细胞培养体系，然后进一步建立对虾永生性细胞系。

1 仪器与材料

1.1 仪器

pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；HH-2恒温水浴锅(江苏金坛市宏华仪器厂)；311型直热式CO2培养箱(赛默飞世尔上海仪器有限公司)；Multiskan MK3型酶标仪(赛默飞世尔上海仪器有限公司)；TKA-GenPure超纯水系统(广东丹利科技有限公司)；BG-stirrer 1DB磁力搅拌器(北京百晶生物技术有限公司)；TS100倒置显微镜[尼康仪器(上海)有限公司]；Olympus相差显微镜；FA2204B电子天平；无菌眼科剪；培养瓶。

1.2 材料与试剂

选择体色正常、健康活泼、体重适中的凡纳滨对虾，在循环池中配于人工海水(盐度为8.0‰)，在25℃室温通气养殖。

MTT购自北京Solarbio公司；DMEM、MEM、L-15培养基粉剂及Grace培养液均购自GIBCO公司；M199培养液购自HyClone公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程材料有限公司；青链霉素混合液(100×)购自江苏碧云天生物技术研究所。

1.3 培养基及试剂的配制

DMEM、MEM培养基：取整包DMEM、MEM培养基粉末，溶于900 ml超纯水，pH值调至7.4～7.6，定容至1 L，无菌条件下0.22μm微孔滤膜过滤灭菌，冷冻保存。

L-15培养基：取整包L-15培养基粉末，溶于450 ml超纯水，pH值调至7.4～7.6，定容至500 ml，无菌条件下0.22μm微孔滤膜过滤灭菌，冷冻保存。

D-HANKS 缓冲液：称取 NaCl 8 g、KCl 0.4 g、Na2HPO40.48 g、KH2PO40.6 g、NaHCO30.35 g，溶于900 ml超纯水，定容至1 L。

MTT试剂：称取MTT 0.5 g，溶于100 ml磷酸缓冲液(PBS)，pH值调至7.4。0.22μm滤膜过滤，4℃避光保存。在配制和保存的过程中，容器用铝箔纸包住。

2 方法与结果

2.1 细胞计数

取20μl细胞悬液于血球计数板上，在Olympus相差显微镜下直接计数，观察计数细胞数量。

2.2 对虾肝胰脏原代细胞培养

2.2.1 肝胰脏原代细胞分离

将循环水池中饲养一周的成年凡纳滨对虾浸泡于4℃预冷70%的乙醇中5 min，灭菌D-hanks缓冲液冲洗2～3次，酒精棉球擦净体表。取对虾肝胰脏于无菌小烧杯中，D-hanks冲洗2～3次后用无菌眼科剪及镊子剔除结缔组织。在5 ml含2 000 IU/ml青霉素、2 000μg/ml链霉素的培养基中浸泡40 min后(期间更换一次培养基)，弃去培养基，用无菌眼科剪剪成1 mm3组织块，转移至10 ml无菌离心管，加入5 ml培养基并充分吹打，静置5～10 min。取上层培养基1 ml转移至新的无菌离心管，加入青链霉素并调至1 000 IU/ml青霉素、1 000μg/ml链霉素，按试验需求加入一定比例的FBS，调节至所需细胞浓度。每孔体积200 μl接种到96孔板，置于26～28 ℃，5%CO2恒温培养箱中培养。

2.2.2 MTT法测定肝胰脏细胞存活率

上述原代细胞用培养液配成单个细胞悬液，用血球计数板进行细胞计数，以每孔5×105个细胞接种到96孔板，每孔体积200 μl，置于26～28 ℃，5%CO2恒温培养箱中培养24 h后，每孔加MTT溶液20μl，孵育4 h，终止培养。5 000 r/min离心5 min，吸弃孔内培养上清液。每孔加150μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。在酶标仪上595 nm测定OD值并记录结果。

2.3 原代肝胰脏细胞的显微观察

原代肝胰脏细胞培养形态及细胞类型如图1所示。

图1 倒置显微镜观察原代培养肝胰脏细胞(400×)

对虾肝胰脏由四种类型细胞组成，分别为：胚性细胞(E,embryo cells)、纤维细胞(F,fibrillar cells)、吸收细胞(R,resorptive cells)、泡状细胞(B,blister-like cells)。泡状细胞(又称分泌细胞)的功能是分泌消化酶类，成熟分泌细胞中的液泡大，集中于细胞顶部，电镜下可以观察到很多平行排列的粗面内质网用以旺盛合成消化酶类（B）。吸收细胞的功能是吸收营养物质，其中的大脂滴就是脂类物质的储存形式（R）。纤维细胞通常被认为是分泌细胞分泌后细胞体萎缩过程的残留形态（F）。胚性细胞是一种保持分化潜能的细胞，细胞可分化成分泌细胞或吸收细胞，其活性相对要弱一些，故没有出现内质网等细胞器分化（E）。

2.4 不同培养条件对肝胰脏细胞生长的影响

培养12 h后，利用MTT法观察五种培养基(DMEM、MEM、GRACE、2×L-15和M199)对肝胰脏细胞存活率的影响。结果发现：采用2×L-15培养基肝胰脏细胞存活率最高，达到62.9%；GRACE培养基最低，为52.4%；五种培养基维持细胞存活率的高低排名为2×L-15＞DMEM＞MEM=M199＞GRACE(图2)。结果说明2×L-15培养基具有最优培养效果。

图2 不同培养基对肝胰脏细胞存活率影响

同时，将不同pH值 (6.8、7.2、7.6和8.0)、渗透压(Na-Cl添加量：0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%和2.0%)、FBS(添加量：0%、5%、10%、20%、30%和40%)添加至2×L-15的培养基，MTT法测定肝胰脏细胞悬浮培养12 h后的效果。结果发现：肝胰脏细胞存活率在测定范围内，随pH值增加呈先增后降的趋势；pH值为7.6时，肝胰脏细胞存活率最高，达到68.2%；pH值为6.8时，肝胰脏细胞存活率最低，为57.1%(图3)。随NaCl添加量的增加呈先增后降的趋势；当NaCl添加量为1.2%时，培养基渗透压约为706 mmol/kg，肝胰脏细胞存活率最高，达到67.2%；当NaCl添加量为0%时，肝胰脏细胞存活率最低，仅为57.5%(图4)。肝胰脏细胞存活率并没有因添加FBS有显著提升，其最高细胞存活率出现在添加量为5%～10%时，分别为63.3%和61.6%，且FBS添加量超过10%其细胞存活率反而被抑制，低于未添加FBS组(图5)。因此，肝胰脏原代细胞培养最优条件是：pH值为7.6，NaCl添加量为1.2%，FBS添加量为5%。

图3 不同pH值对肝胰脏细胞存活率影响

图4 不同渗透压对肝胰脏细胞存活率影响

图5 不同浓度FBS对肝胰脏细胞存活率影响

3 讨论

通过比较在几种培养基下的细胞存活率发现，2×L-15更适合凡纳滨对虾肝胰脏细胞的原代培养，且以2×L-15为基础培养基，pH值调至7.6，1.2%NaCl以调节渗透压，加入5%FBS时为最优培养体系。在对虾细胞培养的研究工作中，不同研究者所用的培养基不尽相同，其中以L-15使用最为广泛。Manohar等采用改进的L-15培养基将斑节对虾肝胰脏细胞成功培养至45 d。王宏伟以M199为基础培养基，pH值7.6时细胞聚集成团状结构，多数细胞贴壁，生长良好。Ludeman等将培养基调节至6.8～7.2在培养凡纳滨对虾肝胰脏原代细胞时，也取得了不错的效果。试验发现，2×L-15添加1.2%NaCl，其渗透压约为706 mmol/kg时，能够促进肝胰脏细胞存活；与Hu等培养中国明对虾淋巴组织采用的渗透压为(720±10)mmol/kg接近，略低于Chen等培养斑节对虾淋巴组织时选择的渗透压(760±10)mmol/kg。对虾细胞培养中应用最多的是胎牛血清，多数学者选择的血清添加浓度为10%～20%。但本研究发现，5%～10%FBS更适合凡纳滨对虾肝胰脏细胞的培养，过高的FBS添加量会抑制肝胰脏细胞的存活。尽管本研究基于L-15培养基优化了凡纳滨对虾肝胰脏细胞的培养条件，但是培养效果并不理想，因此需进一步探究对虾细胞生长所必需的营养成分和理化条件，以获得适于对虾细胞生长的理想培养基。