尚海，郝志强，傅熙博，华向东，马作红，艾福录，冯照强，王坤，李文心，李博

（辽宁省肿瘤医院肝胆胰科，沈阳 110042）

原发性肝细胞癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在恶性肿瘤中排第3位，恶性程度极高，至今尚无有效的治疗方法，5年生存率较低，仅在30%左右。而肝癌细胞的增殖活性与其发生、发展、侵袭、转移密切相关。小分子生物活性肽具有独特的生物学特性，结构简单、组织分布广泛、生物效应多样，在机体调节中具有十分重要的作用。多种细胞因子和小分子多肽在肝癌的发生、发展中起到重要作用。中介素（intermedin，IMD）属于降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）超家族，于2004年首先在硬骨鱼中发现［1］，之后人们又相继在其他物种cDNA基因克隆中发现该活性肽。IMD在体内分布广泛，在肾上腺皮质肿瘤［2］、直结肠癌［3］中的表达均高于正常组织，还可促进血管新生［4］，提示IMD与肿瘤的发生、发展相关。本文探讨了IMD在肝细胞癌中的作用及其相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

重组人IMD（IMD1⁃53）及其受体拮抗剂（IMD17⁃47）购于美国Phoenix Pharmaceuticals公司；CCK⁃8细胞增殖检测试剂盒购于日本同仁化学公司；RNA提取及逆转录试剂盒、萤光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Promega公司；Taq酶购于北京天根公司；Evergreen荧光染料购于美国Biotium公司；经典Wnt通路阻断剂IWR⁃1⁃endo购于美国Cayman公司；Wnt信号通路活性检测TOPFlash/FOPFlash质粒购于美国Millipore公司；JetPEI转染试剂购于美国Polyplus⁃transfection公司。

1.2 CCK⁃8检测细胞增殖

将处于对数生长期的HepG2细胞以1×104/100 μL接种于平底96孔板，12 h后更换含不同浓度（1～100 nmol/L）IMD的RPMI 1640培养液，或者加入IMD 17⁃47、IWR⁃1⁃endo处理，以不含IMD的RPMI 1640完全培养液作为对照，于48 h取板，每孔加入10 μL CCK⁃8，孵箱内放置1～4 h，使用酶标仪测定450 nm波长的光吸收值［5］。

1.3 RNA提取

采用Promega公司的Trizol试剂：细胞吸出培养液后PBS洗涤，加入1 mL RNAtrip试剂反复吹打30次；移入EP管中，室温放置10 min；加入氯仿0.2 mL，剧烈颠倒混匀15 s，室温放置5 min；4℃、12 000 g离心15 min；小心吸出上层水相转移到新EP管中，加入等体积异丙醇充分混匀，-70℃沉淀2 h；4℃、12 000 g离心10 min。弃上清；用预冷的1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，4℃、12 000 g离心10 min；弃上清，用枪头小心洗去附在管壁上的液滴。待沉淀周围透明、中间稍白时，加适量去RNA酶纯水溶解并定量。

1.4 实时定量PCR

逆转录反应为20 mL反应体系，2 mg RNA起始量，使用Promega公司的逆转录试剂盒进行cDNA第一链的合成。实时定量PCR为25 mL反应体系，逆转录反应混合物1 mL为模板。扩增条件：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72℃30 s，延伸72℃5 min。40个循环。以Strata⁃gene Mx3000软件进行分析。引物序列：人c⁃myc：上游 5′⁃TGCTCCATGAGGAGACACC⁃3′，下游 5′⁃CTTTTCCACAGAAACAACATCG⁃3′；人cyclin D1：上游 5′⁃GAAGATCGTCGCCACCTG ⁃3′，下 游 5′⁃GACCTCCTCCTCGCACTTCT⁃3′；人β⁃actin上游 5′⁃ATCTGGCACCACACCTTC⁃3′，下游 5′⁃AGCCAGGT CCAGACGCA⁃3′。

1.5 荧光素酶活性测定

HepG2细胞种植于12孔板中，以JetPEI试剂转染0.5 μg各种质粒后孵育24 h。之后收获细胞并匀浆。然后以Promega公司的Dual⁃LuciferaseTMRe⁃porter Assay System 检测荧光素酶活性［6］。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 IMD呈剂量依赖关系性诱导HepG2细胞增殖

CCK⁃8检测显示，不同浓度（5～100 nmol/L）的IMD作用48 h均可以显著促进HepG2细胞的增殖（P＆lt;0.05）。见图1。

图1 IMD呈剂量依赖性促进HepG2细胞增殖Fig.1 IMD promotes the proliferation of HepG2 cells in a dosedependent manner

2.2 IMD促HepG2细胞增殖的作用呈受体依赖性

进一步研究发现，IMD受体的竞争性拮抗剂IMD 17⁃47（100 nmol/L）可显著抑制IMD（10 nmol/L）的促增殖作用。因此，IMD可以呈剂量依赖性促进HepG2细胞的增殖，并且具有受体依赖性。见图2。

2.3 IMD激活HepG2细胞经典Wnt信号通路

我们进一步探讨了IMD促HepG2细胞增殖的可能机制。Wnt信号传导通路在肿瘤细胞的增殖过程中起着非常重要的作用。我们以TOPFlash为报告质粒，FOPFlash为阴性对照，以pRL⁃TK作内参对照，转染6 h后，以IMD（10 nmol/L）处理24 h后进行双荧光素酶活性检测，结果显示IMD刺激下TOP⁃Flash/FOPFlash比值明显高于对照组（P＆lt;0.05，图3A），下游靶基因c⁃myc与cyclin D1 mRNA水平明显上调（P＆lt;0.05，图3B）。说明IMD作用下经典Wnt信号途径被激活，转录活性明显增强。

图2 IMD受体拮抗剂抑制IMD对HepG2细胞的促增殖作用Fig.2 The proliferation of HepG2 cells induced by IMD was inhibitedby IMD receptor antagonist

图3 IMD激活经典Wnt信号通路Fig.3 IMD activates classical Wnt signaling pathway

2.4 Wnt信号通路抑制剂IWR⁃1⁃endo可在一定程度上抑制由IMD导致的HepG2细胞增殖

给予Wnt信号通路抑制剂IWR⁃1⁃endo（25 μmol/L）提前处理细胞1 h后，可以显著抑制IMD（10 nmol/L）诱导的HepG2细胞增殖。因此，IMD可能通过Wnt信号通路促进HepG2细胞的增殖。见图4。

3 讨论

本研究首次证实了人IMD可通过经典Wnt信号途径促进HepG2肝癌细胞的增殖。依据如下：（1）IMD处理HepG2肝癌细胞可直接引起其增殖；（2）IMD受体竞争性拮抗剂IMD17⁃47可阻断上述作用；（3）IMD可激活经典Wnt信号转录活性及下游靶基因mRNA水平；（4）阻断Wnt信号途径可在一定程度上抑制由IMD导致的HepG2细胞增殖。

图4 Wnt信号通路抑制剂IW R⁃1⁃endo抑制IMD对HepG 2细胞的促增殖作用Fig.4 Inhibition of Wnt signaling pathway impairs the effects ofIMD⁃induced HepG2 cell proliferation

IMD是CGRP超家族成员，与肾上腺髓质素（ad⁃renomedullin，AM）的氨基酸结构有30%相似性，也被称为AM2。其前体由148个氨基酸残基组成，有多个蛋白酶切位点，在体内可被剪切为IMD 1⁃47、IMD 8⁃47及IMD1⁃53三个活性片段［7］。CGRP家族通过与降钙素受体样受体/受体活化修饰蛋白复合物共同受体（calcitonin receptor⁃like receptor/receptor activity⁃modifying protein receptor complexes，CRLR/RAMPs）相结合发挥效应［8］。CGRP 主要作用于RAMP1，AM作用于RAMP2/3，而IMD无选择性地作用于RAMP1/2/3，因此IMD可能具有更广泛的生物学效应［1］。IMD在内环境稳态调节以及高血压、心肌缺血、心功能衰竭和肾功能衰竭等疾病过程中的作用已有很多研究。虽然研究中发现IMD在肾上腺皮质肿瘤、直结肠癌、胰腺癌、乳腺癌中的表达均高于正常对照组，但是IMD在肿瘤，尤其是肝癌发生发展中的作用，尚不明确。我们的研究表明，IMD有促进HepG2肝癌细胞增殖的作用（图1），且这种作用是通过受体依赖性实现的（图2）。自分泌假说提出，很多肿瘤细胞可通过对其本身分泌的生长因子的反应，从而逃离生长抑制［9，10］。我们的研究也表明，在未给予外源性IMD刺激的条件下，IMD受体拮抗剂IMD17⁃47仍然可以抑制基础水平下HepG2细胞的增殖（图2），提示HepG2细胞本身即可以表达和分泌IMD，与Guo等［11］的研究结果相吻合。

Wnt信号传导通路在肿瘤细胞的增殖过程中起着非常重要的作用，经典Wnt信号通路的激活有赖于β⁃catenin在细胞质中异常蓄积而后入核，通过与T细胞因子/淋巴增强因子（T⁃cell factor/lymphoid en⁃hancing factor，TCF/LEF）形成转录因子复合体，调控下游靶基因如cyclin D1和c⁃myc的转录表达［12，13］。研究表明，30%～40%的肝癌发生Wnt通路的失调或β⁃catenin基因突变；62%～70%的肝癌出现胞质和胞核的β⁃catenin表达，在分化程度较差的肝癌细胞核内可以看到β⁃catenin的表达更明显［14～16］。c⁃myc是第一个被发现的β⁃catenin/TCF复合物的下游靶基因，在细胞凋亡、增殖、代谢、DNA修复以及血管形成等各种生物学过程中发挥关键作用［17］；cyclin D1基因是β⁃catenin/TCF途径的另一个直接靶基因，若持续高水平表达，可使细胞停留于细胞周期的S期，过度增殖进而发生恶性转化［18］。我们的研究中，TOPFlash/FOPFlash荧光素酶检测结果表明，IMD可增强β⁃catenin/TCF的转录活性；且Wnt下游靶基因cyclin D1和c⁃myc的转录表达明显上调。提示IMD激活Wnt信号通路，进而促进HepG2细胞的增殖。

总之，本研究发现，作为CGRP超家族成员，IMD通过与受体结合，激活Wnt信号通路发挥其促肝癌细胞增殖作用，为肝癌的治疗提出新的思路。IMD拮抗剂可能作为抗肝癌的治疗手段之一。

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