杨奇，郭阳，徐锐，谷学军，张莹，铁梅，*

（1.辽宁大学化学院，辽宁沈阳110036；2.辽宁大学环境学院，辽宁沈阳110036；3.辽宁大学稀散元素研究所，辽宁沈阳110036）

人体内的自由基被认为会引起生物细胞氧化性损伤，进而引起癌症、衰老、心血管疾病等慢性病[1-4]。与人关系最密切的自由基有、·OH和ROO·。的毒性是机体发生氧中毒的主要原因，表现在使核酸链断裂、多糖解聚和不饱和脂肪酸过氧化作用，进而造成遗传突变、膜损伤、酶系失灵等一系列变化[5]。在体内形成最早，通过岐化反应或Fenton反应可生成·OH。·OH对细胞的破坏作用最强，同时也是脂质过氧化的引发剂[6]。因此对自由基清除能力的研究，对相关疾病的防治有着重要的意义。

食用菌不仅味道鲜美，营养丰富，而且含有一些对人体非常有益的活性物质，被人体吸收后可产生多种生理功能，例如抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血糖和降血脂等[7]。硒是人体必需的微量元素，其生理功能主要表现为硒蛋白和硒酶的抗氧化作用[8]，使生物体内的过氧化物还原成无毒的水或醇，从而达到清除活性氧自由基的目的[9-10]。已有研究发现灵芝中硒蛋白具有清除羟自由基和超氧阴离子的作用[11]，但对富硒金针菇和富硒虫草中硒蛋白的抗氧化性的研究较少。本研究利用甲基紫-Fe2+-H2O2体系[12]和邻苯三酚自氧化体系[13]分别研究了富硒食用菌中硒蛋白清除羟自由基和超氧阴离子的活性，为富硒食用菌的开发利用提供了依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

HZQ-Q全温震荡器：哈尔滨东联电子技术开发有限公司；冷冻离心机：美国科峻电器公司；PHSJ-4A型酸度计：上海雷磁仪器厂；7500c型ICP-MS：美国Agilent公司；Cary 50紫外-可见分光光度计：美国VARIAN公司。浓盐酸（优级纯）：北京化工厂；考马斯亮蓝G250（分析纯）、邻苯三酚（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；硫酸铵（分析纯）、30%过氧化氢（分析纯）：沈阳力诚试剂厂；甲基紫（分析纯）：沈阳市试剂三厂；硫酸亚铁（分析纯）：沈阳新兴试剂厂；实验用水为二次蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 硒蛋白的制备

称取富硒食用菌干样1.0 g，加20 mL，pH为3.5的Tris-HCl溶液，在全温振荡器搅拌提取2.0 h，抽滤至干，滤液保留，收集残渣，重复操作1次，合并滤液。根据溶液体积准确称量一定量的硫酸铵，边搅拌边向烧杯中缓慢加入硫酸铵至其饱和度为95%，透析后，分别以考马斯亮蓝染色法[14]和ICP-MS法[15]测蛋白浓度C蛋白和硒含量C硒，其余放在-20℃下储藏备用。

1.2.2 硒蛋白对羟自由基的清除作用

H2O2和Fe2+发生Fenton反应产生·OH。·OH容易进功高电子云密度点，会与甲基紫中具有高电子云密度的-C=C-基团发生亲电加成反应，而使甲基紫褪色。通过测定甲基紫吸光度值的变化可间接测定出·OH的生成量。

在10 mL比色管中依次加入1.4 mL 2×10-4mol/L的甲基紫溶液、0.1 mL 0.1 mol/L pH=3.5的Tris-HCl溶液、1.2mL 1×10-3mol/L的Fe2+溶液。另一试管加入上述试剂，再加1 mL 0.12%的H2O2溶液，两试管均用去离子水补足10.0mL，摇匀，放置30 min后，在波长582 nm处测定吸光度，计算加H2O2与不加H2O2的A582之差△A582。

在上述体系中，加入一定量的硒蛋白提取物，摇匀后再加H2O2，30 min后测定吸光度，则硒蛋白清除率S按以下公式计算：

1.2.3 硒蛋白对超氧阴离子自由基的清除率作用

在试管中按表1加入缓冲溶液和二次蒸馏水，于25℃恒温20 min后加入25℃预热过的邻苯三酚（对照管用0.01 mol/L盐酸代替），迅速摇匀，立即倾入光径1 cm的比色杯中，在波长320 nm处测定反应启动后4.5 min时的吸光度值A空。

表1 邻苯三酚自养化速率测定加样表Table 1 Protocol of the pyrogallol autoxidation velocity operation

在上述体系中，加入邻苯三酚前，先加入一定量的硒蛋白，并减少同体积二次蒸馏水，其它操作均与上述相同，所测吸光度为A样。则硒蛋白清除率S按以下公式计算

1.2.4 硒蛋白对超氧阴离子自由基生成的抑制率测定

2 结果与讨论

2.1 蛋白及硒含量的确定

ICP-MS法测定硒含量的标准曲线如图1所示，考马斯亮蓝染色法测定蛋白含量的标准曲线如图2所示。

图1 硒标准曲线Fig.1 Standard curve of the content of the selenium

图2 蛋白标准曲线Fig.2 Standard curve of the content of the protein

经考马斯亮蓝法和ICP-MS法测定，虫草硒蛋白C硒为 19.352 3 μg/L，C蛋白为 126.17 mg/L， 金针菇硒蛋白 C硒为 19.574 8 μg/L，C硒为 95.83 mg/L。

2.2 硒蛋白对羟自由基的清除作用

按照产生羟自由基工作原理设计的反应体系，分别加入C蛋白空白蛋白、C硒Se的亚硒酸钠溶液、硒含量C硒的富硒食用菌硒蛋白，使得蛋白质的浓度或硒的浓度在同一水平，加入量1、3、5 mL，从而分为由低到高三种不同的浓度组，在波长582 nm处测定吸光度。根据公式（1）得到清除率如下。

从图中可以看出不同浓度的亚硒酸钠、普通食用菌蛋白和硒蛋白对羟自由基均有清除作用，并且随着浓度的增大，清除率随之增加，但较缓慢。硒蛋白对羟自由基的清除效果要明显好于与之浓度相同的亚硒酸钠和普通食用菌蛋白的效果。无论是低浓度，还是高浓度，空白蛋白和亚硒酸钠对·OH的清除率之和小于富硒食用菌蛋白对·OH的清除率，且存在极显著差异，说明硒与食用菌蛋白之间在清除自由基方面存在协同作用。

图3 富硒虫草硒蛋白对羟自由基的清除率Fig.3 The scavenging effects of selenoprotein of Se-enriched Cordyceps militaris on hydroxyl radical

图4 富硒金针菇硒蛋白对羟自由基的清除率Fig.4 The scavenging effects of selenoprotein of Se-enriched Flammulina velutipes on hydroxly radical

2.3 对超氧阴离子自由基的清除作用

按照产生超氧阴离子工作原理设计的反应体系，分别加入不同量的C蛋白空白蛋白、C硒Se的亚硒酸钠溶液、硒含量C硒的富硒食用菌硒蛋白，使得蛋白质的浓度或硒的浓度在同一水平，在波长320 nm处测定吸光度。根据公式（2）得到清除率如下。

图5 富硒虫草硒蛋白对的清除率Fig.5 The scavenging effects of selenoprotein of Se-enriched Cordyceps militaris on superoxide anion

图6 富硒金针菇硒蛋白对的清除率Fig.6 The scavenging effects of selenoprotein of Se-enriched Flammulina velutipes on superoxide anion

从图中可以看出不同体积的亚硒酸钠、普通食用菌蛋白和硒蛋白对超氧阴离子均有清除作用，随着体积的增加，三者对的清除率呈上升趋势，但幅度不大。在用量为3 mL时，趋于平缓。在不同浓度下，富硒食用菌蛋白对的清除率均高于普通食用菌蛋白以及亚硒酸钠，说明硒增强了食用菌蛋白消除的活性。富硒食用菌蛋白对的清除率小于空白蛋白和亚硒酸钠对的清除率之和，说明硒与食用菌蛋白之间在清除方面不存在协同作用。

2.4 对超氧阴离子自由基的抑制作用

根据公式（3）得到抑制率如图7和图8。

图7 富硒虫草硒蛋白对生成的抑制率Fig.7 The inhibitting effects of selenoprotein of Seenriched Cordyceps militaris to superoxide anion free radical

图8 富硒金针菇硒蛋白对生成的抑制率Fig.8 The inhibitting effects of selenoprotein of Se-enriched Flammulina velutipes to superoxide anion free radical

从图中可以看出不同用量的亚硒酸钠、普通食用菌蛋白和硒蛋白对超氧阴离子的生成均有抑制作用，且抑制率随着三者的用量增大而增大。富硒食用菌蛋白对生成的抑制作用均显著高于普通食用菌蛋白以及亚硒酸钠。

2.5 硒蛋白对·OH和的清除能力比较

当富硒食用菌硒蛋白的用量相同时，考察其对羟自由基和超氧阴离子的清除作用。

图9 硒蛋白对两种自由基的清除作用比较Fig.9 Comparision of selenoprotein scvenging capacity between·OH and

从图9中可以看到不论是虫草硒蛋白，还是金针菇硒蛋白，对羟自由基的清除作用显著地强于超氧阴离子。

3 结论

通过研究得到以下结论：（1）富硒食用菌硒蛋白对羟自由基和超氧阴离子都有一定的清除作用。在一定范围内硒蛋白浓度越高，其清除率越强。（2）硒蛋白对·OH具有良好的清除作用，且清除效果要比与其相同浓度的无机硒、及蛋白都要明显，硒与食用菌蛋白之间存在协同作用。（3）硒蛋白在清除超氧阴离子时，富硒食用菌蛋白对的清除率均高于普通食用菌蛋白以及亚硒酸钠，说明硒增强了食用菌蛋白消除的活性，但硒与食用菌蛋白之间不存在协同作用。（4）硒蛋白浓度相同条件下，对羟自由基的清除作用强于对超氧阴离子。