赵文越，王雪青，*，邵明辉，宋文军，赵国强，付庆伟

（1.天津市食品与生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134；2.唐山迁西县板栗产业研究发展中心，河北唐山064300）

植物精油（essential oil）是植物体内的由分子量相对较小的简单化合物组成，具有挥发性和特有芳香性气味，可随水蒸气蒸馏而得到的油状液体[1]，按其化学结构可分为脂肪族、芳香族和萜类3大类化合物以及它们的含氧衍生物，属于植物次生代谢产物[2]。近年来发现植物精油除了可作为香精、香水的用途之外，还有杀虫、抗菌和防腐等生物学功能，如丁香花、月桂叶[3]、牛至、罗勒[4]、玫瑰[5]、百里香[6]等天然植物精油不仅具有自身独特的香气而且还有抵抗各种病菌功能，在崇尚自然的今天，受到人们的特别关注与重视。

然而植物精油在植物组织中的含量相当稀少，一般在0.5%左右[7]，加之提取材料产量有限，导致精油的价格十分昂贵，限制了天然精油的广泛应用。板栗花作为板栗的副产物，伴随着板栗种植面积的不断增加，每年有大量板栗花产出，仅河北省迁西县就有70万亩4 000余万株板栗树，而一般每平方米树冠垂直投影面积就有花序254个[8]，但板栗花大多被当作废物丢弃，不仅污染了环境，而且造成资源的大量浪费[9]。因此，开展对板栗花的综合利用与开发，不仅能解决板栗花污染问题，更能够提高当地栗农的经济收入，因而具有显著的社会和经济效益。

板栗花香气怡人，民间有焚烧干板栗花驱蚊的用法，但是对板栗花精油的相关研究甚少，本工作拟采用水蒸气蒸馏法提取板栗花精油并测定其体外抑菌功能，为板栗花综合开发利用提供基础参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 板栗花

由河北省唐山市迁西县板栗研究发展中心提供，采摘后于避光处晾干，保存备用。

1.1.2 试剂

化学试剂均为市售分析纯。

1.1.3 菌种

大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：由天津商业大学微生物保藏中心提供。

1.2 仪器与设备

Φ24mm挥发油提取器：天津玻璃仪器厂；RE-52A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SN510C立式灭菌锅：重庆雅马拓科技有限公司；LRH-150生化培养箱：上海一恒科技有限公司等。

1.3 实验方法

准确称取50.0 g板栗花与蒸馏水按不同的料液比混合后置于1 000 mL的圆形烧瓶A中，装置见图1。

图1 精油制备示意图Fig.1 Schematic diagram of the essential oil from Chestnut flower used by steam distillation

分离器B中加入25.00 mL的捕集溶剂正己烷，连接实验装置并自冷凝管C向分离器B中添加蒸馏水至溢入蒸馏瓶为止。电热套加热，从冷凝管处滴下第一滴液体时计时并保持微沸状态，蒸馏不同时间，停止加热后冷却20 min，将水相和有机相一起收集称重后放到-20℃冰箱中冷冻一定时间，待水相完全结冰后取出，分离出有机相并称重。同时，不添加板栗花做空白对照组，得到有机相萃取精油前后的质量差，即得精油质量并计算精油提取率。收集一定量的有机相后经无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发即得精油，将得到的精油置于棕色瓶后于4℃冰箱中避光保存[10]。

式中：m为板栗花精油质量，g；n为板栗花质量，g。

1.4 板栗花精油抑菌作用

1.4.1 抑菌性测定

采用抑菌圈法[11]测定抑菌作用。用打孔器将定性滤纸制成9 mm的圆形纸片，灭菌后备用。在无菌环境下，吸取已活化的浓度为 1×105CFU/mL～1×106CFU/mL的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和啤酒酵母菌悬液100 μL分别接种到牛肉膏蛋白胨培养基和YPD培养基中，涂布均匀，在每个含菌平板上贴上3张已灭菌的滤纸片，滤纸片之间保持一定距离。其中两个滤纸片各滴加5 μL的板栗花精油，另外一个滴加5 μL正己烷作为对照组，每个菌种平行测定3次。贴完滤纸片后将平板放入生化培养箱，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌放置在37℃条件下培养24 h，啤酒酵母置于28℃条件下培养48 h，培养结束后选取抑菌圈明显的平板测定抑菌圈直径大小，结果取3次试验的平均值，比较抑菌效果。

1.4.2 板栗花精油最低抑菌浓度（MIC）及最低杀菌浓度（MBC）的测定

取1 mL板栗花精油，用正己烷梯度稀释为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8 μL/mL 一系列不同体积浓度的精油，吸取100 μL供试菌液分别接种到相应的培养基中，涂布均匀，每个平板放3张灭菌滤纸片，每组滤纸片上滴加不同浓度的板栗花精油，共7组。细菌平板放置在37℃条件下培养24 h，真菌平板放置在28℃条件下培养48 h，出现抑菌圈的最小板栗花精油浓度即为最小抑菌浓度（MIC），继续培养一个周期，仍存在抑菌圈的板栗花精油浓度则为最低杀菌浓度（MBC）[12]。

1.5 实验设计及数据处理

首先通过单因素试验研究不同提取工艺参数对水蒸气蒸馏提取板栗花精油提取率的影响；在此基础上，再通过正交试验优化精油的提取工艺。实验数据采用三次实验平均值加误差（+s）表示，并用spss16.0软件分析其显著差异性。

2 结果与分析

2.1 板栗花精油提取工艺研究

2.1.1 板栗花破碎度对精油得率的影响

称取板栗花粉末、1cm短段和整段的板栗花50.0g，按料液比（质量体积比g/mL，下同）1∶10加入浓度（质量浓度，下同）为50 g/L的氯化钠溶液500 mL，电热套加热，从冷凝管处滴下第一滴液体时计时并保持微沸状态，蒸馏2 h，测定板栗花精油得率，结果见图2。

图2 粉碎度对精油得率的影响Fig.2 Effects of the Chestnut flower's size on the yield of essential oils

如图2所示，手工切断的板栗花精油得率明显高于经组织捣碎机粉碎成粉末和未进行任何加工的整段的精油得率，故选择1 cm短段作为最佳破碎度。

2.1.2 蒸馏时间对精油得率的影响

分别蒸馏 1、2、3、4、5 h 之后，测定精油得率，结果见图3。

图3 蒸馏时间对精油得率的影响Fig.3 Effects of distillation time on the yield of essential oils

如图3所示，当蒸馏时间小于3 h时，精油得率随着蒸馏时间的增加而明显增加，并在3 h达到最大，为0.582%，之后精油得率呈略微下降趋势。

2.1.3 料液比对精油得率的影响

分别选择料液比 1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（g/mL），测定精油得率，结果见图4。

如图4所示，精油得率随料液比的增大呈现先增大后逐渐减小的趋势，在料液比为1∶10时达到最大，为0.328%，之后略有下降。

图4 料液比对精油得率的影响Fig.4 Effects of the ratio of material to solvent on the yield of essential oils

2.1.4 蒸馏液中氯化钠浓度对精油得率的影响

分别选择蒸馏液中氯化钠浓度 0、25、50、75、100 g/L，测定精油得率，结果见图5。

图5 NaCl浓度对精油得率的影响Fig.5 Effects of NaCl concentrations on the yield of essential oils

如图5所示，精油得率出现随氯化钠浓度的增大先增大后减小并趋于稳定的趋势，氯化钠浓度在50 g/L时达到最大，为0.328%，比未添加氯化钠的精油得率提高了25%（P＜0.01），比添加100 g/L的氯化钠提高了 4%（P＜0.01）。

2.2 板栗花精油提取工艺的优化

通过以上单因素试验结果选择恰当的单因素水平做正交试验，对蒸馏时间、料液比以及氯化钠浓度进行条件筛选，以精油得率为指标，选用L9（34）正交表，设计三因素三水平9个试验组，见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Levels and factors in the orthogonal design

采用spss16.0软件进行数据分析，所有水平重复3次，取平均值。试验结果见表2，数据分析见表3。

表2 水蒸气蒸馏提取板栗花精油正交试验结果Table 2 Yields of essential oils extracted by steam distillation through orthogonal tests

表3 正交试验方差分析表Table 3 Analysis of variance table of orthogonal experiment

由表 2 直观分析可知：极差比较 RA＞RB＞RC，说明3个因素对精油得率的影响效果大小依次为：蒸馏时间＞料液比＞氯化钠浓度。由表3可知，蒸馏时间P值（0.000）＜料液比 P 值（0.009）＜0.01＜NaCl浓度 P 值（0.233）与K值分析结果一致，说明蒸馏时间和料液比是极显著地影响因素。根据各因素的K值分析可知，板栗花精油较优化提取工艺为A2B2C1，而直观分析正交试验9组数据中精油得率最高的是A2B2C3为0.618%，由于上述由K值分析的较优化组合在正交试验中不存在，同时也与正交试验中精油得率最高的组合不一致，因此，此优化组合要进行验证试验，验证试验结果见表4。

表4 优化组合验证试验Table 4 Verification tests of optimal technology

由表4可知，3次优化组合的精油得率的平均值为0.621%，高于正交试验组中精油得率最高的A2B2C3，因此，优化组合A2B2C1是水蒸气蒸馏提取板栗花精油的最好提取工艺，即板栗花1 cm短段与浓度为40 g/L氯化钠的蒸馏液按1∶10的料液比（g/mL）混合，蒸馏3 h，得到的板栗花精油得率最高。水蒸气蒸馏法提取的板栗花精油常温下为淡黄色透明，同时伴有浓厚的板栗花气味的油状液体。比重计测定其比重为0.687。

2.3 板栗花精油抑菌活性的研究

采用抑菌圈法测定板栗花精油对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和啤酒酵母的体外抑菌活性，抑菌圈直径大小见表5。

表5 板栗花精油对3种供试菌的抑菌作用Table 5 Inhibition of the essential oils from Chestnut flower on three kinds of bacteria tested

板栗花精油最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）结果见表6和表7。

表6 3种供试菌的最低抑菌浓度（MIC）Table 6 Minimum inhibitory concentration of the essential oils from Chestnut flower on the three tested bacteria

表7 三种供试菌的最低杀菌浓度（MBC）Table 7 Minimum bactericidal concentrations of the essential oils from Chestnut flower on the three bacteria tested

由表5可见，板栗花精油对3种供试菌种有不同程度的抑菌作用。比较而言，抑菌能力大小依次为：啤酒酵母＞枯草芽孢杆菌＞大肠杆菌。由表6和表7可见，板栗花精油对大肠杆菌最低抑菌浓度最大，MIC为125 μL/mL；对枯草芽孢杆菌和啤酒酵母的最低抑菌浓度相同，MIC为62.5 μL/mL；板栗花精油对啤酒酵母的最低杀菌浓度最小，MBC为62.5μL/mL；对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最低杀菌浓度相同，MBC为125 μL/mL。可见，板栗花精油对啤酒酵母的杀菌效果好于对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的杀菌效果。

3 讨论

植物精油是从植物细胞中萃取出的芳香精华成分，提取有水蒸气蒸馏、溶剂浸提、压榨、CO2超临界萃取等多种工艺[13]。水蒸气蒸馏法由于其设备简单、操作容易，成本低、对环境友好、所得精油质量好等特点而被广泛应用。本研究采用水蒸汽蒸馏法，以精油得率为指标，研究了物料破碎度、蒸馏时间、料液比以及蒸馏液中氯化钠浓度4个因素对其影响的大小。

通常提高植物精油提取率的做法是将物料破碎，增加与蒸馏液的接触面积，从而使其与蒸馏液充分接触，水散作用彻底。本实验采用经组织捣碎机粉碎的粉末、1 cm短段和未破碎的整段板栗花3个破碎度研究其对精油得率的影响，结果显示，1 cm短段板栗花的提取率最高，粉末的提取率最低，相比，较整段降低了 2.2%（P＜0.05）， 较 1 cm 短段降低了 23%（P＜0.01）（见图2），其原因可能是板栗花在机械粉碎的过程中，由于受到剧烈摩擦，造成板栗花中的一些热敏性/挥发性的物质破坏/挥发，从而导致精油得率的下降。另外，粉末状的板栗花在水蒸气蒸馏过程中，随着蒸馏时间的延长，物料聚集成团，从而发生爆沸的“冲团”现象[14]，造成部分粉末残留在蒸馏瓶壁上，进而被烧焦，不但影响精油得率，而且也破坏了挥发油整体气味；而整段的板栗花，由于与蒸馏液接触不充分，一定程度上影响精油得率；1 cm短段的板栗花克服了粉末和整段在蒸馏过程中的不足，得到的精油不仅得率高，且颜色纯正、气味芳香，是最好的破碎度。应丽亚[15]等研究物料破碎度对玫瑰花精油得率的影响时发现，玫瑰花经过粉碎后精油得率（0.042%）比未经粉碎的（0.063%）降低了50%（P＜0.01），与本实验结果一致。

蒸馏时间在水蒸气蒸馏过程中起着至关重要的作用，蒸馏时间的长短直接决定着精油得率的大小。本实验中蒸馏时间是考察的3个因素中对结果影响最为显著地（见表3）。精油得率随蒸馏时间呈现先明显增大后略微减小的趋势（见图3）。这可能是由于在蒸馏初始，精油与水蒸气形成共沸大量馏出，随着蒸馏时间的延长，料液中大部分油类组分被蒸出，油水比降低，共沸点升高，精油馏出量减少，精油量基本保持稳定。但蒸馏时间越长，精油中水溶性成分损失越多，蒸馏液的温度也随之升高，使分离器中液面部分的精油挥发，导致精油得率下降。何跃君[16]等在研究蒸馏时间对竹叶挥发油得率的影响时发现，在前3个小时精油得率明显上升，之后略微下降并保持稳定，与本实验结果相一致。

料液比在精油提取过程中也是一个比较重要的影响因素。本实验发现，精油得率随料液比的增大先增大后逐步减小并趋于稳定（见图4），分析原因可能是料液比过小，蒸馏液与板栗花接触不够充分，水解作用进行不彻底，势必影响精油得率；料液比增加，降低溶剂中精油浓度，增加精油与溶剂接触界面的浓度差，从而提高传质速率，精油得率随之增加[17]；液料比过大，精油在水中的溶解量随之增大，导致精油得率降低。同时，加热时间延长，能耗也会随之增加，造成不必要的能源浪费，所以，从精油得率和能源节约角度考虑，1∶10是最佳料液比。

有文献报道，在蒸馏液中添加一定浓度的氯化钠，可以提高精油得率[18-19]。本实验也证实添加一定浓度的氯化钠，精油得率有明显的提高。精油得率随氯化钠浓度出现先增大后减小的趋势（见图5）。其原因可能是由于稀溶液的依数性改变了纯溶液的一些物理性质[20]，导致溶液的蒸汽压下降、沸点相应升高，精油更容易馏出，得率也随之升高；也可能是蒸馏液中由于氯化钠的存在降低了精油中某些成分在水中的溶解度，导致精油得率增加。但氯化钠浓度过大，精油得率出现下降的趋势，这可能是由于高盐溶液的高渗作用，阻止了细胞内的精油组分馏出；同时，沸点升高，溶液容易发生爆沸，也影响精油得率。Rivera[21]等在研究水蒸气蒸馏提取葛缕子精油时发现精油得率随氯化钠浓度的增高出现先增大后减小的变化趋势，最佳的氯化钠浓度为60 g/L。实验结果与本实验趋势相同。

植物精油化学成分复杂，可由50～500种不同的萜烯类、醛类、酯类、醇类等化学分子组成，在赋予不同的芳香气味的同时，具有抗细菌、霉菌、病毒等功能，其中萜烯类成分大多有抑菌作用[22]，本研究证实板栗花精油具有一定的抑菌作用，也表现出一定的抑菌选择性（见表5～表7）。精油的抑菌作用和抑菌选择性很大程度上取决于精油的活性组分种类。岳晓霞[23]等应用平板抑菌圈法考察丁香精油对酵母菌、枯草杆菌和大肠杆菌的抗菌作用，通过测定抑菌圈直径大小表明，丁香精油对酵母菌的抑制性最强，其次是枯草杆菌和大肠杆菌。实验结果与本实验基本一致。我们用GC-MS对板栗花精油组成成分进行分析，得到19种化合物，其中芳樟醇含量占总精油的9.46%，是主要成分之一。芳樟醇属于链状萜烯醇类，有报告指出，芳樟醇的抗菌效果是苯酚的五倍，对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大肠杆菌等均具有抗菌活性[23]。吴建挺[24]等研究了天竺葵精油中6种主要成分对6种植物病原真菌的抑菌活性，研究发现，芳樟醇的抑菌活性最高。可见，芳樟醇是板栗花精油中起抑菌作用的主要成分之一。

植物精油的沸点一般在70℃～300℃之间，其中大部分成分的沸点都集中在180℃～250℃[25]。板栗花精油在抽真空低温（0.09 MPa，35℃）旋转蒸发下损失极小，从而保证了精油的完整度。但是，在水蒸气蒸馏提取过程中，由于温度较高，一定程度上会破坏植物中的热敏性物质，造成低沸点成分流失，从而影响精油香气的完整性。水蒸气蒸馏提取工艺还有待进一步完善和提高。

4 结论

水蒸气蒸馏提取板栗花精油的最佳提取条件为：板栗花1 cm短段，料液比（g/mL）为1∶10，蒸馏液氯化钠质量浓度为40 g/L，蒸馏时间为3 h，精油提取率为（0.621±0.008）%。

板栗花精油对3种供试菌种有不同程度的抑制作用。比较而言，板栗花精油对3种供试菌种的抑菌能力大小依次为：啤酒酵母＞枯草芽孢杆菌＞大肠杆菌。

板栗花不仅资源丰富、价格低廉而且其精油具有良好的芳香和抑菌防腐性，因此，研究板栗花精油的提取方法和抑菌特性对探索新型食品防腐剂具有重要意义。