司艳芳 樊旭 关娟 周历 赵娟

增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是裂孔源性视网膜脱离手术失败常见的原因［1］。在 PVR膜的细胞成分中最重要的细胞之一是视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞。研究发现，RPE细胞的增生与PVR发病机制相关［2-5］。非转移性黑色素瘤糖蛋白 B(glycoprotein nonmetastatic melanoma protein b，GPNMB)是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白［6］，广泛表达于多种组织［7］。研究表明GPNMB与多种疾病的生理、病理过程相关［8］。但尚未有文献报道GPNMB对RPE细胞生物学功能的影响。因此，本研究采用免疫荧光、酶联免疫吸附试验、MTT等方法，检测GPNMB在不同病变程度PVR中的定量表达以及GPNMB对RPE细胞增殖、细胞周期的影响，拟在探讨GPNMB在PVR病变中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料来源 收集解放军309医院在2012年1月至12月确诊的18例PVR患者的视网膜表面增生膜。患者年龄15～60岁。PVR病变程度分级标准参照1991年美国视网膜学会的分级方法，分为A、B、C 3级。

1.2 主要仪器及试剂 CO2细胞培养箱(Binder公司，德国)，酶联免疫检测仪(Sheldon公司，美国)，流式细胞仪(Olympus，日本)，激光共聚焦显微镜(Bio-Rad公司，美国)。限制性内切酶 EcoRI、XhoI，T4连接酶，RNA 酶，胰蛋白酶(Takara，大连)，LipofectamineTMRNAiMAX，载体 pMD19-T、pcDNA3.1(+)(Invitrogen，美国)，抗 GPNMB抗体、抗生物素标记的Texas Red、FITC标记的膜联蛋白(Abcam，美国)，M254 培养基、G418、MTT、碘化吡啶(GIBCO BRL，美国)。

1.3 引物及 siRNA GPNMB-P1:5’-AACCTTGAGTGCCTGCGTC-3’，GPNMB-P2:5’-ACTT-CCCCAAACCACAATATCTA-3’;GPNMB-P3:5’-CCGGAATTCATGGAATGTCTCTACTATTTCCTGGGAT-3’，含 EcoRI酶切位点;GPNMB-P4:5’-CCGCTCGAGTCATTAAGAAACTCCTTTAAATTCTTG-3’，含 XhoI酶切位点。靶向 GPNMB的 siRNA序列:GPNMB(sense:5’-GGGCAAUGAAAGACCUUCUTT-3’，antisense:5’-AGAAGGUCUUUCAUUGCCCTT-3’)。所有引物均由上海生工合成。

1.4 方法

1.4.1 免疫荧光 石蜡标本常规脱蜡，进行如下操作:滴加正常羊血清(1∶50稀释)，室温温育 30 min;漂洗后与抗 GPNMB(1∶50稀释)一抗于4℃孵育过夜;漂洗后与生物素标记的二抗(1∶50稀释)在37℃温育30 min;最后滴加抗生物素标记的Texas Red(1∶1000稀释)，于37℃放置30 min。磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗后用甘油封片，于激光共聚焦显微镜下观察并进行定量分析。……