董家龙， 李菊香， 孙国芳， 洪 葵

(1南昌大学第二附属医院心内科，江西省分子医学重点实验室，江西 南昌 330006； 2赣州市南康区第一人民医院心内科，江西 赣州 341400)

Rho相关的卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil protein kinase，ROCK)是新近发现的与细胞凋亡相关的激酶，是激活的caspase-3的直接裂解产物，ROCK有2个亚单位，即ROCK1和ROCK2。研究表明ROCK与心肌损伤、心肌细胞凋亡及心力衰竭有关联[1]。然而，ROCK在缺血性心肌损伤中与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路有何关系？目前尚不清楚。本研究旨在观察缺氧诱导心肌细胞凋亡过程中，ROCK1和ROCK2的变化及其与心肌PI3K之间的关系。

材 料 和 方 法

1 材料

Sprague-Dawley乳鼠(出生1～3 d) 雌雄不限，由南昌大学医学院医学实验动物科学部提供(动物合格证：医动字 021-9602)。DMEM高糖培养基及胎牛血清(FBS)购自HyClone；胰蛋白酶购自Sigma；山羊抗鼠ROCK-1Ⅰ抗、山羊抗鼠ROCK-2Ⅰ抗、兔抗鼠caspase-3Ⅰ抗、兔抗鼠p-PI3KⅠ抗、兔抗鼠PI3KⅠ抗均购自Santa Cruz；抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化试剂盒购自武汉博士德；MTS溶液购自Promega；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物有限公司

2 方法

2.1原代心肌细胞的培养及鉴定 取健康乳鼠，利用0.08%胰酶消化3次后，离心弃胰酶，接着用1%II型胶原酶消化心肌组织1～2 h，至组织消化完全，以含15% FBS的DMEM培养基(1∶1)终止消化，室温下离心5 min，收集细胞沉淀以15% FBS的DMEM培养基充分重悬，200目滤网过滤细胞悬液至培养皿，置CO2培养箱培养，经差速贴壁2 h后，加入0.1 mmol/L 5’-BrdU抑制成纤维细胞的生长，以1×109/L的细胞密度接种于35 mm的培养皿中，待心肌细胞生长接近汇和状态及呈现同步搏动时开始实验。48 h后，取有心肌细胞生长的玻片，用37 ℃ PBS漂……