杨 朝， 耑 冰， 张丽萍， 赵 霞， 张建银， 葛利军， 吴昌归

(宁夏人民医院 1总院呼吸内科， 2心血管内科，宁夏 银川 750011； 3第四军医大学西京医院呼吸内科，陕西 西安 710000)

缺氧时选择性收缩肺动脉对于调节动脉氧合作用非常重要，然而，在机体整个处于缺氧状态下，如呼吸系统疾病或高原缺氧等，缺氧肺血管收缩(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)导致肺动脉压力异常增高，长期反复发生可以形成或加剧肺动脉高压(pulmonary hypertension)的发生发展[1]。目前HPV发病的分子机制，如肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs) 哪个部位感知缺氧、缺氧信息如何转导最后导致肺动脉收缩还不十分清楚。多数研究认为PASMCs线粒体感知缺氧并始动了HPV的发生[2-3]，线粒体产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，主要是过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)在传递缺氧信息中起着重要的作用，但线粒体在缺氧时产生ROS的位点还不很清楚。Michelakis等[4]研究认为缺氧可以引起线粒体电子传递链(electron transport chain，ETC)复合物I及III位点产生ROS减少从而导致HPV，而更多研究认为线粒体ETC复合物I、II、III和IV均与HPV有关[5-6]。因此，本研究通过激光扫描共聚焦显微镜观察缺氧时PASMCs 产生ROS的变化，同时直接分离线粒体，用荧光分光光度法检测其生成量及生成的具体位点。

材 料 和 方 法

1 动物和试剂

健康成年雄性SD 大鼠体重(200±15) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，自由进食饮水；DMEM、胎牛血清 (fetal bovine serum，FBS)青、链霉素均为Gibco产品；二硫苏糖醇 和4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸 [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid, HEPES] 购自Roche；α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)单克隆抗体购自Abcam；生物素化山羊抗小鼠IgG购自Santa Cruz；SABC试剂与DAB显色剂购自Pierce；胶原酶I、分子探针chloromethyl dichlorodihydrofluorescein diacetate(CM-H2DCF/DA)和RedoxSensor Red CC-1、线粒体ETC复合物I抑制剂……