许春芳 许乐乐

吉西他滨是一种新型嘧啶类抗代谢药，主要作用于DNA合成期和晚G1期，并可阻止细胞由G1期进入S期，是近30年来美国食品和药物管理局(FDA)批准的第一个用于晚期胰腺癌治疗的新药。尽管吉西他滨单药方案已经成为胰腺癌辅助治疗的标准方案，但其疗效仍不能令临床医师满意，且存在的不良反应也是阻止其更广泛应用的主要原因，因此开发高效低毒的抗癌新药和采用联合化疗方案仍是临床努力的方向。本课题组前期研究[1]已证实浅蓝菌素可以有效抑制胰腺癌细胞的生长并诱导细胞凋亡。为提高对化疗药物的敏感性，本研究进一步观察浅蓝菌素联合吉西他滨是否对胰腺癌细胞的生长抑制具有协同作用，并探讨其可能的机制。

材料和方法

一、实验材料

BxPC3细胞株由第二军医大学附属长海医院馈赠。浅蓝菌素购于美国 Sigma 公司(批号 C2389)，-20℃保存，用<0.1%二甲基亚砜(DMSO)稀释成50 mg/ml原液，再用含10%胎牛血清的1640培养液稀释成所需要的浓度。吉西他滨购于美国Sigma公司，实验前用灭菌水稀释成所需要的浓度。CCK-8购自日本同仁公司。AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒购自Molecular Probes公司。Trizol购自Invitrogen公司。PCR所用试剂均购自TaKaRa公司。兔抗人Bcl-2、Bax抗体购自EPITMICE公司。鼠抗人β-actin单抗及羊抗兔和羊抗鼠二抗、细胞周期与凋亡检测试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。

二、实验方法

1．CCK-8法：取对数生长期BxPC3细胞，混悬于含有10%胎牛血清的1640培养液中，调整细胞密度为5×104/ml。取100 μl加入96孔板培养24 h，弃培养基，分别加入含10 μg/ml浅蓝菌素、20 μmol/L吉西他滨、10 μg/ml浅蓝菌素+20 μmol/L吉西他滨(联合)的培养液继续培养细胞24、48、72 h，以加不含药物培养液的细胞作为对照组。然后每孔加入CCK-8溶液10 μl，37℃孵育4 h。上酶联免疫检测仪检测每孔450 nm波长的吸光度值(A450值)，以单纯培养液的空白孔调零，计算细胞生长抑制率(IR)。IR=[1-(A450值对照组-A450值处理组)/A450值对照组]×100%。实验重复3次，取均值。

2．AnnexinV/PI双染法：BxPC3细胞培养至对数生长期，弃培养液，分别加入上述3种含药……