张露艺 唐国都 唐曦平 梁志海 詹媛

急性胰腺炎(AP)是一种炎症性疾病，胰胆管结石、饮酒、暴饮暴食、病毒感染等是常见的病因。这些病因导致胰腺自身消化，胰腺实质细胞损伤，发生变性坏死，在胰腺内形成无菌性炎症[1]。Toll样受体家族(Toll like receptor，TLR)是机体固有免疫的重要部分，组成机体对抗炎症的第一道防线。研究报道[2]，Toll样受体家族与AP发病的病理生理关系密切，但其具体作用机制尚未阐明。本研究应用脂多糖刺激正常大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J，构建AP体外细胞模型，观察细胞TLR7、TLR 9表达的变化，探讨其在AP发病机制中的作用。

材料和方法

一、细胞培养及模型建立

大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J购自美国ATCC(American type culture collection)，常规培养、传代。取传代2次且生长良好的对数生长期细胞，以1×106个细胞/孔接种到6孔培养板中培养24 h，分别加入含1、10、100 mg/L脂多糖(Sigma公司)的完全培养基继续孵育24 h，以不加脂多糖的细胞作为对照组。收集培养上清液和细胞备用。实验重复3次。

二、细胞TLR7、TLR9 mRNA表达的检测

采用RT-PCR法检测。应用Trizol(Omega公司)抽提各组细胞总RNA。先应用逆转录试剂盒(Fermenta公司)逆转录成cDNA，再采用RT-PCR方法检测TLR7、TLR9 mRNA表达。TLR7引物上游为5′-CCACCGAATCTAACGACTCTCT-3′，下游为5′-ACAAACCACACAGCATCACAGT-3′，扩增产物365 bp；TLR9引物上游为5′-GCTGTCAATGGCTCTCAGTTC-3′，下游为5′-GGGAGGTAGTTGAGGTTCTGG-3′，扩增产物425 bp；内参GAPDH引物上游为5′-CATGGTCTACATGTTCCAGT-3′，下游为5′-GGCTAAGCAGTTGGTGGTGC-3′，扩增产物349 bp。引物序列由上海生工生物技术有限公司合成。反应条件： 95℃ 4 min，95℃ 30 s、 60℃ 30 s、72℃ 30 s，35个循环，72℃延伸7 min。产物经电泳分离后，由凝胶成像系统扫描测量条带灰度值，以目的条带与内参条带灰度值比表示mRNA相对表达量。

三、细胞TLR7、TLR9蛋白表达的检测

应用总蛋白提取试剂盒(碧云天公司)提取细胞总蛋白，应用BCA试剂盒(碧云天公司)测蛋白浓度。……