徐妍 张慧 刘江峰 朱玉婷 田爱峰 范长斌 黄江勇 吴瑛 于淼 林凤燕 赵爽 陈晶砺 毕晓云

双磷酸盐是一种人工合成药物，广泛用于骨吸收性疾病，尤其适用于60岁以上老年患者[1]。这类药物也用于骨肿瘤及肿瘤骨转移的辅助治疗。双磷酸盐可调节骨代谢，主要作用在于吸附于破骨细胞表面，抑制破骨细胞活性，引起破骨细胞凋亡，从而导致骨吸收减少[2]。近年来的研究表明，双磷酸盐也可作用于其他类型细胞，包括成骨细胞、成纤维细胞和内皮细胞，抑制细胞增殖，减低细胞活性，抑制细胞分泌生长因子和Ⅰ型胶原[3-6]。在吸附双磷酸盐的骨组织表面可以形成新骨，但药物与新生骨中的基质结合后不再具有药理活性，必须持续服用这类药物，以抑制新形成骨表面的破骨细胞。然而，骨坏死是长期服用双磷酸盐严重的副作用，发生机制尚不清楚，但推测可能与其对成骨细胞的毒性有关。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是一种成体干细胞，具有分化为成骨细胞、成脂肪细胞和成软骨细胞等的能力。MSC广泛存在于骨髓及骨实质组织中。双磷酸盐的毒性反应是否与MSC有关，至今尚未见报道。我们以帕米膦酸二钠为研究对象，观察药物处理后的人骨髓MSC在表面分子表达、增殖状态及成骨分化能力等的变化，以探索双磷酸盐导致骨组织损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人骨髓MSC为本研究室保存，取第1～3代细胞用于实验。帕米膦酸二钠注射液(2 mg/mL)为国内药物制剂。胎牛血清(Stem Cell公司，加拿大)。MTT、地塞米松、维生素C磷酸盐、β磷酸甘油、人胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠和磷酸对硝基苯酚(Sigma公司，美国)。小鼠抗人CD31、CD44、CD45、CD73抗体(BD公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 人骨髓MSC的复苏与培养

[7]的方法。取液氮冻存的人骨髓MSC 3份，37℃快速复苏，滴加于含10%胎牛血清的α-MEM培养基中，离心洗涤后按10 000 cells/cm2底面积接种于100 mm培养皿中。37℃、5%CO2条件下培养72 h，胰蛋白酶消化，PBS洗涤2次，将细胞悬浮于α-MEM基础培养基中，调整细胞浓度为1×106cells/mL，用于后续实验。

1.2.2 MTT实验

收取人骨髓MSC，悬浮于含1%FCS的α-MEM中，调整细胞浓度为1.0×106cells/mL。体系中分别加入终浓度为0 μg/mL、0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL的帕米膦酸二钠，以终浓度为10%的FCS为阳性对照。在上述体系中加入MSC悬液30 μL/mL。将细胞悬液转移至96孔板，每孔100 μL。将细胞置于37℃、5%CO2条件下培养72 h，加入MTT溶液。酶联免疫仪上测定每孔光密度值，测定波长为490 nm。以上实验重复3次，分别采用3个骨髓标本来源细胞。

1.2.3 流式细胞学技术

MSC培养体系中加入1.0 μg/mL的帕米膦酸二钠，培养1周后收集细胞，PBS洗涤2次。加入小鼠抗人CD31、CD44、CD73、CD45单克隆抗体。室温避光反应30 min后，PBS洗涤2次。FACSCalibur(美国BD公司)收集至少10 000个数据点，WINMDI2.9软件分析结果。

1.2.4 成骨诱导分化

将培养的人骨髓MSC，悬浮于含5%FCS的DMEM中，按3.0×103个/孔的密度，接种到24孔板中。分为4组，分别加入含5%FCS的DMEM(阴性对照组)、0.5 μg/mL帕米膦酸二钠、标准诱导剂组合及诱导剂组合+0.5 μg/mL帕米膦酸二钠。诱导剂组合由地塞米松(100 nM)、β-磷酸甘油(10 mM)和维生素C磷酸盐(50 μM)组成。每隔3～4天换液1次。第14天时收集细胞，裂解后分别进行蛋白质浓度及碱性磷酸酶(ALP)活性测定。使用3个不同供者来源的MSC重复上述实验。

1.2.5 碱性磷酸酶活性检测

取第14天细胞，PBS洗涤后冻融裂解。1 500 r/min离心10 min，取上清，Bradford法测定蛋白浓度，结果以OD600表示。配制碱性磷酸酶工作液，包括5 mM磷酸对硝基苯酚水溶液、50 mM甘氨酸水溶液(pH 10.5)、1.0 mM氯化镁水溶液，按1∶1与细胞裂解液混合，37℃反应15 min。加入NaOH终止液后，酶联仪测定405 nm光密度值。将碱性磷酸酶测定的OD405值与各组对应蛋白含量的OD600比值，作为各组单位蛋白重量碱性磷酸酶活性进行比较。

1.2.6 统计学分析

MTT实验所得光密度值以均数±标准差表示，组间差异采用t检验分析，P0.05为差异显著。

2 结果

2.1 不同浓度帕米膦酸二钠对人MSC增殖的影响

在MSC培养体系中加入0.1～10 μg/mL的帕米膦酸二钠，培养72 h，MTT法测定细胞活性。结果显示，当药物浓度为0.1 μg/mL和0.5 μg/mL时，OD490与对照组无显著差别(P0.05)；当药物浓度达到1 μg/mL时，OD490显著低于对照组(P0.05)；之后OD值逐渐减低，以10 μg/mL组最为明显，显著低于对照组(P0.05)(图1)。

图1 不同浓度帕米膦酸二钠对MSC增殖的影响Fig.1The inhibitory effect of different concentrations of pamidronate disodium on the growth of human bone marrow MSCs

图2 帕米膦酸二钠处理的MSC表型分析Fig.2Phenotypic profile of human MSCs treated by parmidronate

2.2 帕米膦酸二钠对MSC表面分子特征的影响

由于1 μg/mL帕米膦酸二钠明显抑制MSC增殖，我们选择0.5 μg/mL作为长期培养时的药物浓度。将细胞培养1周后，流式细胞观察细胞表面分子表达水平的变化。结果显示，MSC仍高表达CD44和CD73，不表达CD31和CD45，提示药物作用后，细胞仍具有MSC表面分子特征(图2)。

2.3 帕米膦酸二钠对MSC体外成骨分化的影响

为观察帕米膦酸二钠是否影响MSC成骨能力，MSC体系中加入0.5 μg/mL帕米磷酸钠，培养2周后裂解细胞，磷酸对硝基苯酚显色，测定OD405以显示细胞碱性磷酸酶活性。结果显示，帕米膦酸二钠组OD405与阴性对照组相当(P0.05)，显著低于标准诱导组(P0.01)，而诱导剂加帕米膦酸二钠组OD值与标准诱导组无差异。鉴于帕米膦酸二钠可抑制MSC增殖，以细胞蛋白总量为指标(OD600)，显示细胞总数，将OD405/OD600作为单位细胞所含ALP活性，获得了近似的结果。以上结果表明，帕米膦酸二钠本身无诱导MSC分化为成骨细胞的功能，也不影响MSC的成骨分化(图3)。

图3 帕米膦酸二钠对MSC体外成骨分化的影响Fig.3Effects of parmidronate on the osteogenic differentiation of MSCs

3 讨论

双磷酸盐是一类治疗骨质疏松和肿瘤骨转移的药物，其主要作用靶点是破骨细胞。我们观察了双磷酸盐对间充质干细胞生物学特性的影响。结果表明，帕米膦酸二钠可抑制MSC体外增殖，效应呈浓度依赖性，但对诱导条件下碱性磷酸酶活性无影响。在相近浓度下，帕米膦酸二钠可抑制人骨髓基质细胞的增殖，抑制其碱性磷酸酶活性，且可促进RANKL分泌，诱导破骨细胞迁徙[8]。造成结果差异的主要原因可能与使用的药物浓度有关。本实验发现1 μg/mL帕米膦酸二钠可明显抑制MSC增殖。为排除细胞增殖抑制作用，本实验采用的药物浓度为0.5 μg/mL。但是，既往文献中所报道的药物浓度为5 μg/mL，是本实验所用浓度的10倍。此外，鉴于文献所使用的浓度条件下，帕米膦酸二钠可抑制细胞增殖，在最终检测时间点，药物处理组细胞数量应大大低于未处理组，因此，直接测定ALP活性，而不考虑细胞总数，不能显示单个细胞酶含量。本实验利用蛋白质总量作为参考，以更好地体现细胞内实际的酶活性，并发现无论细胞培养过程中，或MSC在标准成骨诱导剂作用条件下，加入帕米膦酸二钠组ALP活性与对照组比较，均无明显差异，提示至少在该浓度下，帕米膦酸二钠的确不影响MSC成骨活性。截至目前，双磷酸盐抑制细胞增殖的具体机制尚不清楚，可能与药物直接作用有关[9]。

双磷酸盐主要沉积于骨组织，静脉注射或口服后，外周循环存在时间短。骨组织中富含MSC和成骨细胞，沉积过程中这两种细胞可能受药物的直接或间接作用。研究表明，浓度大于1 μg/mL的帕米膦酸二钠可抑制成骨细胞增殖及Ⅰ型胶原的合成[10]，浓度达到2 μg/mL左右，培养时间超过72 h，大量成骨细胞发生凋亡[11]。在该浓度下，帕米膦酸二钠也明显抑制骨肉瘤细胞增殖，诱导瘤细胞凋亡，提示肿瘤治疗剂量与正常细胞毒性剂量相近。

骨坏死是长期使用双磷酸盐的并发症之一。本研究结果显示，高浓度帕米膦酸二钠可抑制间充质干细胞增殖。既往研究也证实，高浓度帕米膦酸二钠可诱导成骨细胞凋亡[3-6，9－10]。另外，双磷酸盐也可抑制内皮细胞和成纤维细胞活性[3]。可见，对正常细胞的毒性作用可能是双磷酸盐导致骨坏死的原因之一。双磷酸盐沉积于骨组织后代谢缓慢，因此，控制摄入量而非减少摄入时间，可能是减少骨坏死并发症的有用措施。

总之，帕米膦酸二钠可抑制人骨髓MSC增殖，但是，在低浓度条件下，并不影响MSC的成骨分化。本结果可为预防帕米膦酸盐所导致的临床并发症提供参考。

参考文献

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