王露萍 陈炜 余丕军 石潇

皮肤老化过程复杂，受许多细胞因子影响，转化生长因子β(TGF-β)可能在其中起着重要的作用。TGF-β是一类多功能细胞因子，其3种异构体的生物学功能不尽相同。与TGF-β2、3相比，TGF-β1与创伤修复的关系更为密切，对成纤维细胞及其他间叶组织来源细胞的形态发生、增殖和分化过程起着重要作用[1]；TGF-β2能够诱导胚胎发育过程中中胚层的形成，促进毛囊等皮肤辅助结构的形成[2]；TGF-β3对角质细胞和内皮细胞的增殖具有强烈的抑制作用[3]。本实验旨在探讨TGF-β1，2，3在不同年龄SD大鼠皮肤组织中表达的变化，及其可能的生物学意义，深入揭示TGF-β与皮肤衰老过程的关系和内在规律，为进一步研究人类皮肤衰老机制提供相关动物实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及材料

采用清洁级成年雌性SD大鼠(上海斯莱克实验动物中心)12只。其中，2月龄6只(青年组)，18月龄6只(老年组)，取颈背部4 cm×4 cm大小皮肤组织，备用。

TGF-β1抗体SC-146、TGF-β2抗体SC-90、TGF-β3抗体SC-82(Santa Cruz公司，美国)；hrp标记的山羊抗兔IgG(Jackson Immunology公司，美国)

1.2 实验方法

采用Western blot检测两组大鼠皮肤样本中TGF-β1，2，3的蛋白表达情况。

组织块匀浆后PBS冲洗，重悬洗涤离心，收获细胞。细胞沉淀加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂混合液(100∶1)裂解1 h，12 000 r/min，4℃离心10 min，取上清液，加入上样缓冲液，95℃水浴10 min，-80℃保存。比色法测定蛋白浓度，定量上样，进行SDS-PAGE电泳1.5～2.0 h。转膜后加一抗稀释液(TGF-β1抗体SC-146，TGF-β2抗体SC-90，TGF-β3抗体SC-82)，稀释浓度1∶5 000，4℃过夜。第2天PBS-T洗膜后加入稀释的二抗，hrp标记的山羊抗兔IgG(1∶10 000)，37℃孵育1 h，PBS-T洗膜，ECL化学发光法检测显影。底片通过凝胶灰度分析软件Image J进行灰度值定量。

1.3 统计学处理

实验所得数据均采用SPSS17.0软件进行方差齐性和正态分布检验，并通过单因素ANOVA分析比较均值。结果以均值±标准差表示，P0.01为差异具有统计学意义。

2 结果

TGF-β1在青年组大鼠皮肤中呈强阳性表达(Western blot灰度值相对定量1.91±0.67)，而在衰老组大鼠的皮肤组织呈阴性表达(Western blot灰度值相对定量0.14±0.09)，两者比较差异有统计学意义(P=0.0001)，说明TGF-β1在皮肤衰老过程中的表达存在显著差异。

TGF-β2在青年组Western blot灰度值相对定量为0.16±0.07，衰老组该值为0.1±0.04，均呈阴性表达(P=0.17)。

TGF-β3在青年组Western blot灰度值相对定量为0.95±0.20，衰老组该值为0.80±0.26，均呈阳性表达(P=0.26)(图1-4)。

图1 TGF-β1蛋白电泳(Western blot)Fig.1Expression of TGF-β1 by western blot

图2 TGF-β2蛋白电泳(Western blot)Fig.2Expression of TGF-β2 by western blot

图3 TGF-β3蛋白电泳(Western blot)Fig.3Expression of TGF-β3 by western blot

图4 TGF-β1，2，3蛋白相对定量Fig.4Relative quantification of TGF-β1,2,3

3 讨论

皮肤衰老是一个复杂的、多因素作用引起的一系列功能与美学改变的过程，与遗传、免疫、自由基、成纤维细胞、细胞外基质、细胞因子等诸多因素有关。老化皮肤的组织学改变主要表现为胶原蛋白减少和弹性纤维片段增加；分子学改变主要表现为表皮增生和分化性标志表达异常[4]。成纤维细胞作为真皮中的主体细胞成分，在衰老的过程中发挥了核心作用[5-6]。其主要生物学功能是分泌胶原纤维、弹性纤维及各种基质成分，如硫酸软骨素及透明质酸等，和各种蛋白质的复合物，如蛋白多糖。这些共同构成了皮肤充盈、承受拉力、保持光滑有弹性的物质基础[7]。衰老皮肤的成纤维细胞数量逐渐减少、合成胶原蛋白和弹性蛋白的能力下降，且Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的比例变小，胶原纤维变粗，出现异常交链。同时分泌基质降解蛋白酶(MMPs)增加，MMPs能特异性降解几乎所有的细胞外基质成分，使胶原纤维减少、弹性纤维断裂紊乱，皮肤出现皱纹[8]。

研究表明，TGF-β三种异构体在皮肤表皮层、真皮层以及毛囊和汗腺细胞内都有表达[10]。与TGF-β2，3相比，TGF-β1作为成纤维细胞的主要趋化因子，与创伤修复、皮肤老化的关系显得尤为密切；TGF-β2随着毛囊的发育成熟，其在毛囊细胞内表达显著增强，而TGF-β3则在角质细胞和血管内皮细胞内表达明显。

TGF-β1对成纤维细胞及其他间叶组织来源的细胞有明显的刺激作用，主要分布于表层基底细胞及胞外基质中，可以通过增加基质蛋白的合成，如胶原蛋白、糖蛋白的表达和分泌，加强细胞黏附蛋白受体的转录、翻译和处理过程；并可减少MMPs的合成，对细胞的形态发生、增殖和分化过程起着重要作用，有利于胚胎发育和细胞修复、组织修复[9]。本实验证实，TGF-β1在不同年龄的SD大鼠皮肤组织中表达有显著差异，在青年组大鼠皮肤中TGF-β1蛋白表达强，而在衰老组大鼠的皮肤组织中呈阴性表达，提示皮肤的生长发育、表型和功能的维持可能存在TGF-β1介导的信号通路参与，并且内源性TGF-β1可能是皮肤修复与再生的重要内源性调控因子。

TGF-β2主要分布于汗腺细胞及毛囊细胞中，能够诱导胚胎发育过程中中胚层的形成，促进毛囊等皮肤辅助结构的形成[10]，在本实验中，各年龄组大鼠的皮肤组织中TGF-β2含量极少，年龄差异不明显，提示TGF-β2在皮肤组织中的含量极微，对皮肤的老化产生的影响可能较TGF-β1、3小。

有研究采用MTT比色法检测TGF-β3对瘢痕组织成纤维细胞增殖活性的影响，并以3H-脯氨酸掺入法检测细胞内胶原合成及TGF-β1蛋白表达情况。结果证实，TGF-β3可抑制成纤维细胞的增殖，下调TGF-β1蛋白及Ⅰ型胶原蛋白表达[11]。本实验中，TGF-β3在不同年龄的SD大鼠皮肤组织中有着相对稳定的表达，年轻组表达少于TGF-β1却明显多于TGF-β2，而老年组表达均高于另外两种蛋白，提示TGF-β3可能在抑制成纤维细胞增殖，下调TGF-β1蛋白及Ⅰ型胶原蛋白表达方面对皮肤的衰老有一定的促进作用。

因此，我们可以认为在三种TGF-β蛋白中，TGF-β1表达的改变可能在皮肤衰老过程中起到主要作用，而TGF-β3通过何种机制对皮肤衰老产生影响还有待进一步的研究证实。

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