傅士博 温从吉 王琛 王丹茹

挛缩性瘢痕严重影响患者容貌，导致局部功能障碍，是整形外科最为常见的疾病之一。肌成纤维细胞因高表达收缩性蛋白α-SMA，并可大量分泌细胞外基质，被认为是瘢痕挛缩和增生的主要原因。目前普遍认为，肌成纤维细胞并非独立细胞类型，而是成纤维细胞受机械张力和炎症刺激发生适应性改变的过渡阶段[1]。

手术治疗瘢痕挛缩，往往会造成明显的供区损伤。随着整形外科治疗技术的不断发展，越来越多突破性治疗理论被提出，部分已经被用于临床(如脂肪注射等)[2]。然而，在研究领域因缺少持久稳定的动物瘢痕模型限制了新技术的研发[3]。通过构建瘢痕体外模型开展相应研究存在两个主要不足，①瘢痕细胞质量不可控:这类研究主要依靠体外培养瘢痕组织中分离的成纤维细胞[4]，但是瘢痕增生存在着明显的个体差异，限制了实验的可控性及可重复性。②平面培养:体内细胞被细胞外基质完全包埋，所受的力也是三维的，而平面培养无法完全模拟这种力学环境[5]。

为了突破这两大局限，我们构建了基于三维培养的人真皮成纤维细胞张力刺激模型，体外诱导其向肌成纤维细胞分化。

1 材料和方法

1.1 实验材料和仪器

人真皮组织来源于2013年8月至2013年12月间我科手术切除的患者多余皮肤组织(获患者知情同意)。

Ⅰ型鼠尾胶原、DMEM高糖/低糖培养液、胶原酶、中性蛋白酶(美国BD公司)；FITC-鬼笔环肽(美国Sigma公司)；滨珊瑚(上海市组织工程研究重点实验室)；硅橡胶板(GY-131，宁海市佳普医用橡胶制品有限公司)；有机玻璃板(HG/T 2713-1995)；抗人α-SMA单克隆抗体(美国Abcam公司)。

ECLIPSE 90i显微镜(日本Nikon公司)，自动CO2培养箱(美国Forma Scientific公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 真皮成纤维细胞分离与培养

将皮肤组织修去皮下组织后，剪成5 mm×1 mm的小条，浸于0.2%中性蛋白酶溶液中4℃低温过夜。次日撕掉表皮，PBS冲洗后剪碎真皮，0.15%胶原酶溶液37℃震荡消化2 h，70 μm尼龙网过滤消化液，1 500 r/min离心5 min，DMEM高糖培养基(10%FBS，1%青链霉素)重悬，置于100 mm培养皿，37℃、5%CO2条件下培养，80%以上融合后传代培养[6]。

1.2.2 拉伸实验

将Ⅰ型鼠尾胶原蛋白(8.05 mg/mL)、HEPES、DMEM高糖培养液(无FBS，1%青链霉素)和FBS以3∶3∶1∶1比例低温(4℃)混合，加入预冷的PBS，调节胶原蛋白浓度至1 mg/mL。每1 mL胶原蛋白液约加入30 μL NaOH溶液(1 M)滴定。将成纤维细胞用上述混合液低温重悬，调整细胞浓度至1×106cells/mL。趁低温将细胞悬液倒入事先放置滨珊瑚小块的模具上，37℃孵育30 min使胶原蛋白凝固[7]。将胶原分为牵拉组和非牵拉组，牵拉组(n=9)安装锚定装置，非牵拉组(n=9)不安装，加入DMEM高糖(10%FBS，1%青链霉素)培养液，37℃培养。分别于第1、3、5天收集胶原块。

含有胶原蛋白的细胞悬液渗入多孔珊瑚块中并凝固后，纤维丝束缠结在空隙间，锚定装置固定多孔珊瑚块，达到对细胞牵拉的目的[8]。

图1 拉伸实验Fig.1Tensile test

1.2.3 免疫荧光染色

将胶原块切下约1 cm×1 cm大小，埋入Tissue Teck OCT冰冻切片包埋剂中，液氮速冻。切成8 μm厚冰冻切片，室温晾干后PBS冲洗3遍，0.3%Triton溶液打孔，37℃孵育15 min。PBS震荡洗涤15 min，加入适量的10%山羊血清封闭，37℃孵育30 min，加入适量的抗人α-SMA溶液(1∶1 500)，4℃冰箱过夜(不小于16 h)，PBS常温洗涤15 min，洗脱抗体，加入Phalloidin-FITC(绿色荧光，5 μg/mL)溶液适量，室温反应30 min，二抗(1∶500，结合TRITC红色荧光基团)37℃孵育45 min，PBS室温震荡洗涤3遍，不少于10 min，DAPI(1∶500～1∶1 000)溶液染核90 sec，PBS震荡洗涤3遍，不少于15 min，荧光防淬灭封片剂、盖玻片封装，待封片剂凝固后观察。为长期贮存防止荧光淬灭，玻片以铝箔包裹，常温干燥处存放[9]。

1.2.4 细胞生长曲线绘制和Real-time PCR检测

将胶原块剪碎后用0.15%胶原酶消化15 min，光镜下血球计数板计数，将不同时间点凝胶中细胞数量绘制成细胞生长曲线。细胞悬液1 500 r/min离心5 min，TRIzol试剂提取总RNA，反应步骤参照cDNA逆转录合成试剂盒(Promega公司)。1 μg总RNA用200 U逆转录酶和20 pM的OligodT合成cDNA，使用引物如表1所示。

表1 引物序列Table 1Primer sequences

1.2.5 统计学分析

采用SPSS 17.0软件对本实验结果进行统计学分析，由于本实验样本总量较小，采用配对t检验，P0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 张力环境下三维培养体系的镜下形态

细胞经过三维力学拉伸，其形态较单纯三维培养细胞显著极化，且极化方向与牵拉方向一致(图2)，细胞质颗粒明显增多，间接地提示了代谢活跃。

图2 三维培养24 h的成纤维细胞形态Fig.1Histological observation of fibroblasts after 3D cultured for 24 hours

2.2 免疫荧光染色

通过对细胞双标染色，发现细胞形态明显由不规则形变为规则的双极化梭形，并且牵拉后的成纤维细胞α-SMA和fibronectin染色亮度(细胞荧光强度-背景杂光)明显高于无张力细胞(图3)。

2.3 凝胶细胞生长曲线(补充实验方法)

台盼蓝染色，细胞计数，绘制细胞生长曲线。结果显示，三维培养环境下细胞增殖缓慢，机械牵拉有促进细胞增殖的趋势，但差异不显著(P＞0.05)(图4)。

图3 三维培养成纤维细胞的免疫荧光染色(400×)Fig.3Immunofluorescent staining of 3D cultured fibroblasts(400×)

图4 细胞生长曲线的比较Fig.4The comparison of cell growth curve between stretch group and non-stretch group

2.4 Real-time PCR

检测张力诱导模型凝胶第1、3、5天标本的α-SMA、Fibronectin和Ⅰ、Ⅲ型胶原基因转录水平。结果显示，第3、5天，实验组α-SMA、纤连蛋白和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达明显高于对照组(P0.05)(n＝3，图5)，而第1天两组mRNA表达均无明显差异(P0.05)。说明机械牵拉可促进成纤维细胞α-SMA、纤连蛋白和Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的转录，单纯应用机械牵拉能够促进其向肌成纤维细胞分化，且该趋势随干预时间的延长而愈加明显。

图5 人α-SMA、纤连蛋白和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA半定量对比Fig.5Comparison of relative quantification of mRNA in human α-SMA,fibronectin,typeⅠandⅢcollagen

3 讨论

挛缩性瘢痕是整形外科最为常见的疾病之一，手术治疗往往引起严重的供区损伤，术后效果难以满足美观需求。

以往的相关研究不能模拟细胞在体内的三维力学环境，而且所采用的瘢痕组织来源的成纤维细胞质量可控性差，使得实验结果无法重复。本研究中，细胞来源为正常皮肤成纤维细胞，通过三维培养和机械牵拉，促使其向肌成纤维细胞分化，突出了研究模型的稳定性和可控性，并且更加符合细胞在体内的力学环境。

本实验发现，三维培养的成纤维细胞增殖极为缓慢，机械牵拉对细胞增殖的影响不显著。细胞-细胞外基质接触是细胞增殖缓慢的关键因素[10]，本模型相比平面培养[11]和弹力膜平面培养[5]更加接近瘢痕或皮肤的组织结构，类似正常组织细胞增殖缓慢。同时，Real-time PCR检测结果显示牵拉组α-SMA、Fibronectin和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达高于非牵拉组，说明细胞开始向肌成纤维细胞分化，这也符合瘢痕挛缩和增生常发生于体表高张力区域的现象[12]。

综上所述，我们认为这种基于成纤维细胞三维培养，通过机械张力诱导皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的模型，稳定性优于既有的瘢痕体外模型，并且细胞-细胞外基质接触更接近细胞在体内的环境。另外，本实验采用了矩形胶原块，牵拉方向单一，相比圆形胶原块更易通过细胞极化方向和程度判断细胞对机械刺激的反应[13]。

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