谢俊霞，马晓梅，韩继红，姚东云，张静

（1.河北化工医药职业技术学院 制药系，河北 石家庄 050026；2.河北大学附属医院 神经内科，河北 保定 071002）

过氧草酸酯类化学发光（PO－CL）是一类以多氯代水杨酸酯与草酰氯反应生成的草酸酯、过氧化氢和荧光剂以及一些增强发光效率的催化剂为主要组成的化学发光体系［1－2］.草酸酯中双（2，4，5－三氯苯基）草酸酯（TCPO）和双（2，4－二硝基苯基）草酸酯（DNPO）最为常用，TCPO 较DNPO 更为稳定，但反应活性低，通常需要一些增强发光效率的碱性催化剂，已报道的催化剂有水杨酸钠、三乙胺、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、咪唑等［1，3－4］，其中咪唑与TCPO 联合使用被认为是最有效的试剂.本文对过氧化草酸酯的多种催化剂和荧光试剂分别进行了比较，发现一种新的催化剂柠檬酸钠，建立了柠檬酸钠催化的过氧草酸酯－四溴荧光素－过氧化氢化学发光体系，该体系可用于儿茶酚胺类物质多巴胺的测定.

多巴胺是下丘脑和脑垂体腺中的一种关键神经元物质，中枢神经系统中多巴胺的浓度则直接影响人们的情绪，多巴胺大剂量使用时有正性肌力作用，收缩血管的作用明显，可使血压升高.其测定方法的研究对神经生理学研究、疾病诊断以及相关药物的质量控制都具有重要意义，检测这类微量神经递质及其代谢产物对研究这类递质的生理机能和有关的疾病诊断尤为重要［5］.

目前测定盐酸多巴胺的方法主要有分光光度法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、电化学分析法及化学发光法.液相色谱分离－电化学检测是目前生物样品中多巴胺测定最有效的方法.但化学发光分析由于其灵敏度高、方法简便而在多巴胺的检测中也得到了广泛的应用［6］，多巴胺化学发光测定体系也已有多篇报道，这些不同的体系可分为以下几类：1）基于多巴胺参与化学发光反应并作为发光体.利用高锰酸钾－盐酸多巴胺体系［7］、二氯荧光素增敏的儿茶酚胺－次氯酸［8］等体系可实现多巴胺的测定.2）利用多巴胺对鲁米诺－KIO4化学发光体系［9－10］的增敏作用进行测定.3）利用多巴胺的化学发光抑制作用.基于在碱性介质中，盐酸多巴胺对鲁米诺－铁氰化钾［11－13］、鲁米诺－次氯酸［14－15］、Fe（Ⅱ）－光泽精［16］化学发光反应体系的强烈抑制作用，建立了反相流动注射抑制化学发光测定盐酸多巴胺的新方法，多巴胺抑制电化学发光［17－18］的定量测定技术也已经建立.4）多巴胺在碱性介质催化剂作用下将多酚转化产生过氧化氢，通过异鲁米诺－过氧化物酶发光体系测定过氧化氢从而间接测定多巴胺［19－21］.

基于碱性介质中在咪唑的催化作用下多巴胺可转化为过氧化氢的性质，将建立的过氧草酸酯发光新体系用于针剂中多巴胺的测定，方法简便，为多巴胺的测定提供了一种灵敏检测技术.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超微弱静态化学发光测定仪（中科院生物物理所）；UV－2401PC紫外可见分光光度计（日本岛津公司）.

1.0×10－3mol／L 双（2，4，6－三氯苯基）草酸酯（bis（2，4，6－trichlorophenyl）oxalate，TCPO）乙腈溶液，1.0×10－3mol／L 罗丹明B（Rhodamine B，RB），1.0×10－3mol／L 四溴荧光素（Tetrabromofluorescein，TBF），柠檬酸三钠，咪唑，十二烷基硫酸钠（SDS），十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），吐温－80，过氧化氢（30%质量分数）.

1.2 实验方法

样品预处理：一定体积的咪唑溶液（50 mmol／L，pH＝10.0 NH3H2O－NH4Cl缓冲溶液）及10μL 53nmol／L多巴胺或样品溶液60 ℃水中反应30min.

化学发光信号的测定：适当浓度的过氧化氢溶液、催化剂及荧光试剂各50μL 混合，注入1.0×10－3mol／L TCPO 溶液50μL，记录发光信号强度.

2 结果与讨论

2.1 试剂注入顺序的考察

过氧化氢、催化剂、荧光试剂及发光试剂TCPO 以不同次序放入发光反应管中，对发光信号影响明显，经过对几种试剂不同的混合及注入顺序比选，其中以过氧化氢、催化剂、荧光试剂首先混合，然后注入TCPO信号强度明显最大.实验中选用该顺序.

2.2 不同催化剂的影响

PO－CL体系中常使用碱性催化剂，水杨酸钠、咪唑在文献中有较多报道［1，3］，实验中分别以水杨酸钠、柠檬酸钠、邻苯二甲酸氢钾、四硼酸钠、咪唑为催化剂，与不加任何催化剂进行对照，发光信号强度结果见图1.除加入四硼酸钠使发光信号略有下降，其他试剂均可有效地提高信号强度.其中以柠檬酸三钠效果最为显著.

图1 不同催化剂的影响Fig.1 Effect of catalyzer on the chemiluminescence intensity

催化剂不仅改变发光强度，发光峰形也有明显改变，如图2所示，加入咪唑和柠檬酸钠催化剂后均使TCPO 体系瞬间发光，峰形尖锐，而柠檬酸钠作为催化剂时峰信号强度是加入常用的咪唑催化剂的3.2倍.

2.3 催化剂浓度的选择

1.0mol／L H2O2、1.0×10－5mol／L 荧光试剂与不同浓度柠檬酸钠或咪唑催化剂各50μL 混合，注入50μL 1.0×10－3mol／L TCPO，对催化剂的浓度进行了考察，结果见图3.由图3可知，使用咪唑作为催化剂，发光信号随其浓度的增加而增强，但咪唑浓度过高会降低发光强度；使用柠檬酸钠作催化剂，实验范围内发光信号随催化剂浓度而增加，但浓度较大时，信号增加速度较为缓慢.柠檬酸钠溶解时速度较慢，后继实验中选用0.1mol／L柠檬酸钠作为催化剂.

由图3还可以看出，四溴荧光素作为荧光试剂，其化学发光强度高于罗丹明，测定中使用TBF.

图2 不同催化剂存在下化学发光信号Fig.2 Chemiluminescence profiles of in presence of different catalysis

图3 柠檬酸钠及咪唑催化剂浓度的影响Fig.3 Effect of concentration of catalyzer on the chemiluminescence intensity

2.4 四溴荧光素浓度的影响

1.0mol／L过氧化氢、0.1mol／L柠檬酸钠与不同浓度的TBF各50μL混合后，按1.2中实验方法测定化学发光信号，结果见图4.发光信号随TBF 浓度的增加而显著提高，而且相对标准偏差呈减小趋势.浓度高于5.0×10－5mol／L后信号增加变缓.

图4 四溴荧光素浓度的影响Fig.4 Effect of concentration of TBF on the chemiluminescence intensity

2.5 表面活性剂的影响

以柠檬酸钠为催化剂，与1.0mol／L H2O2和荧光试剂混合，并分别加入50μL 20g／L阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）；阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）季铵化物和非离子表面活性剂吐温－80，考察表面活性剂对PO－CL体系的影响.各种表面活性剂对发光信号未见显著改善，因此，后继实验中未加任何表面活性剂.

2.6 方法的工作曲线、精密度、检出限、干扰实验及多巴胺注射液的测定

以咪唑为催化剂，在咪唑存在下对多巴胺的转化为过氧化氢的反应温度、pH 等反应条件进行了详细地探讨和优化，本实验参考优化后的反应条件，在pH＝10.0咪唑溶液（50mmol／L）中加入10μL 不同浓度的多巴胺或样品溶液60 ℃水中反应30 min.反应液冷却至室温后用本实验建立的柠檬酸钠催化的TCPOTBF测定.

结果表明，化学发光强度与多巴胺浓度成线性，一元回归方程为：ICL＝22.95＋0.21c，相关系数R＝0.996 9.在2.01～1.00×10－3nmol／L多巴胺浓度内呈线性.

以500nmol／L多巴胺进行11次重复测定，相对标准偏差为10.98%，根据IUPAC的规定，计算得该方法测定多巴胺时3倍标准偏差检出限为1.40nmol／L.

对盐酸多巴胺注射液中共存的成分乙二胺四乙酸二钠、亚硫酸氢钠进行测定，对发光信号在10%误差范围内均不存在干扰.

利用上述建立的以柠檬酸钠为催化剂的过氧草酸酯－四溴荧光素方法测定了3个批号的盐酸多巴胺注射液中多巴胺含量，测定结果见表1.

表1 盐酸多巴胺含量测定结果Tab.1 Determination results of dopamine

2.7 可能的发光机理探讨

多巴胺在碱性咪唑介质中苯环上的羟基转化为过氧化氢［22］，二芳基草酸酯和过氧化氢可发生化学反应，生成一种双氧基中间体储能物，该中间体不稳定，在分解过程中将能量传递给荧光物质，荧光剂在发生化学反应条件下分子结构保持不变，其作用是转移化学能和发射荧光［5］，这些发光反应过程见图5.

图5 多巴胺化学发光测定的反应机理Fig.5 Possible reaction mechanism of CL determination of dopamine

3 结论

建立了以柠檬酸钠为催化剂的过氧化草酸酯－四溴荧光素化学发光新体系，该体系用于多巴胺的测定，直接测定浓度为2～1 000nmol／L，操作简便、灵敏快速，准确度高，可直接用于注射液中多巴胺含量的检测.

［1］ EMTEBORG M，PONTEN E，IRGUM K.Influence of imidazole and bis（trichlorophenyl）oxalate in the oxalyldiimidazole peroxyoxalate chemiluminescence reaction［J］.Analytical Chemistry，1997，69（11）：2109－2114.

［2］ RYU K，YUJI K，JIRO M，et al.Unprecedented chemiluminescence behaviour during peroxyoxalate chemiluminescence of oxalates with fluorescent or electron－donating aryloxy groups［J］.Luminescence，2006，21（3）：164－173.

［3］ JUANA C，MANUEL S，DOLORES P.Improved peroxyoxalate chemiluminescence－based determinations by use of continuous reagent addition to remove background emission［J］.Analytical Chemistry，1994，66（22）：4079－4084.

［4］ ALVAREZ F J，PAREKH N J，MATUSEWSKI B，et al.Multiple intermediates generate fluorophore－derived light in the oxalate／peroxide chemiluminescence system［J］.Journal of the American Chemical Society，1986，108（20）：6435－6437.

［5］ 勾凌燕，刘景东，王憬，等.固相萃取－高效液相色谱电化学法检测大鼠血浆儿茶酚胺［J］.分析试验室，2006，25（1）：90－94.GOU Lingyan，LIU Jingdong，WANG Jing，et al.Determination of catecholamines in rat plasma by oasis HLB solid phase extraction and high－performance liquid chromatography with electrochemical detection［J］.Chinese Journal of Analysis Laboratory，2006，25（1）：90－94.

［6］ ORAWON C，PASSAPOL N，ALONGKORN Y，et al.Recent electrochemical and optical sensors in flow－based analysis［J］.Sensors，2006，6（10）：1383－1410.

［7］ 李丽清，孟兆珂，吕九如.流动注射化学发光法测定多巴胺［J］.泰山医学院学报，1998；19（2）：115－117.LI Liqing，MENG Zhaoke，LÜJiuru.Determination of dopamine by flowinjection analysis with chemiluminescence de－tection［J］.Journal of Taishan Medical College，1998，19（2）：115－117.

［8］ ELZBIETA W，URSZULA N，ANATOL KOJLO.Flow－injection chemiluminescence determination of catecholamines［J］.Instrum Sci Technol，2007，35（2）：219－231.

［9］ 于春玲，唐玉海，韩小年.流动注射化学发光法测定制剂和血浆中的盐酸多巴胺［J］.分析测试学报，2006，25（1）：119－121.YU Chunling，TANG Yuhai，HAN Xiaonian.Determination of dopamine hydrochloride in pharmaceutical samples and blood plasma by flow inject ion chemiluminescence method［J］.Journal of Instrumental Analysis，2006，25（1）：119－121.

［10］ 杜凌云，王术皓，林世蕾.流动注射协同化学发光法测定盐酸多巴胺［J］.分析试验室，2005，24（7）：88－90.DU Lingyun，WANG Shuhao，LIN Shilei.Flow injection chemiluminescence method for determination of dopamine hydrochloride［J］.Chinese Journal of Analysis Laboratory，2005，24（7）：88－90.

［11］ EDYTA N，ROSA B R，ANATOL K.Determination of dopamine by flow－injection analysis coupled with luminolhexacyanoferrate（Ⅲ）chemiluminescence detection［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2004，36（1）：219－223.

［12］ 王术皓，杜凌云，魏新庭，等.反相流动注射－化学发光法测定盐酸多巴胺［J］.光谱学与光谱分析，2005，25（5）：678－680.WANG Shuhao，DU Lingyun，WEI Xinting，et al.Determination of dopamine hydrochloride by a reverse flow injection chemiluminescence method［J］.Spectroscopy and Spectral Analysis，2005，25（5）：678－680.

［13］ WANG Shuhao，DU Lingyun，WANG Liangyu，et al.Flow injection with inhibited chemiluminescence method for the determination of dopamine hydrochloride［J］.Analytical Sciences，2004，20（2）：315－317.

［14］ ZHANG Chengxiao，HUANG Jiachu，ZHANG Zhujun，et al.Flow injection chemiluminescence determination of catecholamines with electrogenerated hypochlorite［J］.Analytica Chimica Acta，1998，374（1）：105－110.

［15］ SUN Yuanyuan，TANG Yuhai，ZHEN Xiaohui，et al.Determination of catecholamines by flow injection chemiluminescence method based on their restraining effects on the luminol－potassium chlorate system［J］.Analytical Letters，2004，37（12）：2445－2458.

［16］ ZHANG Lihe，TESHIMA N，HASEBE T，et al.Flow－injection determination of trace amounts of dopamine by chemiluminescence detection［J］.Talanta，1999，50（3）：677－683.

［17］ LI Feng，PANG Yongqiang，LIN Xiangqin，et al.Determination of noradrenaline and dopamine in pharmaceutical injection samples by inhibition flow injection electrochemiluminescence of ruthenium complexes［J］.Talanta，2003，59（3）：627－636.

［18］ ZHU Liande，LI Yingxiu，ZHU Guoyi.Flow injection determination of dopamine based on inhibited electrochemiluminescence of luminol［J］.Analytical Letters，2002，35（15）：2527－2537.

［19］ ARAKAWA H，KANEMITSU M，MAEDA M.Chemiluminescent assay for catecholamines by the generation of hydrogen peroxide in basic solution and the use of isoluminol－microperoxidase［J］.Analytical Sciences，1999，15（12）：1269－1272.

［20］ LI Baoxin，ZHANG Zhujun，JIN Yan.Plant tissue－based chemiluminescence flow biosensor for determination of unbound dopamine in rabbit blood with on－line microdialysis sampling［J］.Biosens.Bioelectron，2002，17（6－7）：585－589.

［21］ OSAMU N，TOSHINAO I，HIROYUKI M，et al.Chemiluminescent detection of catecholamines by generation of hydrogen peroxide with imidazole［J］.Luminescence，1999，14（3）：123－127.

［22］ LU T T，YOUNJOO P，LIR W F，et al.Increased dopamine D2receptor binding and enhanced apomorphine－induced locomotor activity inμ－opioid receptor knockout mice［J］.Brain Research Bulletin，2003；61（1）：109－115.