王静，赵宁，李萌，张艳杰，张书义，滕国新，宋真，刘宁,，许晓曦

(1.东北农业大学 a.食品学院，b.乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030；2.黑龙江省乳品工业技术开发中心，哈尔滨 150028；3.上海晨冠乳业有限公司，上海 201401；4.全国畜牧总站，北京 100125； 5.北京城市学院，北京100094)

0 引 言

牛乳铁蛋白素(Bovine Lactoferrcin，LfcinB)是牛乳中的乳铁蛋白在酸性环境条件下经胃蛋白酶作用从N端释放的一段多肽[1]，除了不能促进铁的吸收外，完全具备乳铁蛋白生物活性[2]，可用于保健食品、药品中，作为营养强化剂并能提高人的免疫力，有抗癌的作用[3]，且在其发挥抗癌作用浓度范围内对人正常细胞活性没有影响[1]。因此，LfcinB在抗肿瘤方面有相当大的潜力。

目前关于LfcinB抗肿瘤作用研究多集中于其诱导肿瘤细胞凋亡作用[4]，从增殖周期和分化抗原表达水平来探讨LfcinB对肿瘤细胞的抑制增殖、诱导分化作用国内还少有报道。本研究采用流式细胞术分析LfcinB对Jurkat细胞增殖、分化的影响，为进一步深入研究LfcinB抑制白血病细胞增殖、诱导细胞分化的分子机理及其在食品中的应用开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Jurkat细胞，LfcinB，RNA酶，RPMI1640培养基，无支原体胎牛血清，二甲基亚砜(DMSO)，NBT，雷帕霉素，CCK-8试剂盒，碘化丙啶，FITC标记的鼠抗人CD11b抗体。

1.2 细胞培养及处理

将细胞在含有10%热灭活胎牛血清的RPMI1640完全培养基中悬浮培养，并置于37℃质量分数为5%的CO2，相对饱和湿度的孵育箱中培养。取对数生长期细胞，加入一定浓度梯度的LfcinB处理细胞，LfcinB的质量浓度梯度为50，100，200 mg/L和400 mg/L， 阳性对照组培养液中仅加100 nmol/mL的雷帕霉素(RAPA)，以未加LfcinB刺激的对数生长期Jurkat细胞为空白对照组。

1.3 CCK-8法检测LfcinB对Jurkat细胞增殖的影响

取对数生长期的Jurkat细胞，调整细胞浓度接种于96孔培养板中，每孔加入100 μL细胞悬液，加处理因素分别培养24 h、48 h和72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37℃孵育1 h，于酶标免疫测定仪测定450 nm处的吸光值。每组设3个复孔，计算细胞增殖抑制率。

增殖抑制率=[(对照组-空白组)-(给药组-空白组)]/(对照组-空白组)×100%。

1.4 流式细胞术检测LfcinB对Jurkat细胞周期分布的影响

将Jurkat细胞接种于6孔培养板中，加处理因素处理细胞48 h，离心去上清液，PBS洗涤一次，于70%乙醇中4℃固定细胞过夜，1 000 g离心5 min，PBS洗涤一次，加入适量的含RNase的碘化丙啶染色液，重悬细胞，37℃避光孵育30 min，进行流式细胞仪检测，并结合ModFit软件推算出各细胞周期相细胞所占比例，并计算细胞增殖指数(PI)[5]。

式中：G1/G0为处于G1/G0期细胞所占比例；G2/M为处于G2/M期细胞所占比；S为处于S期细胞所占比例。

1.5 NBT还原反应检测LfcinB对Jurkat细胞分化的影响

将浓度为1×106mL-1的Jurkat细胞悬液接种于12孔板中培养24 h，按100 μL/孔接种于96孔板中，设定3个复孔。每孔加入含NBT 1.25 g/L及BSA 17 g/L的PBS混合液100 μL，37℃孵育2 h， 离心去上清， 加入DMSO 150 μL/孔，震荡10 min，酶标仪测定580 nm处OD值。

1.6 流式细胞术检测细胞分化抗原CD11b的表达

将细胞悬液1 mL接种于12孔板中培养24 h，离心弃上清液。用PBS液洗涤一次，500 μL PBS液重悬后加入FITC标记的鼠抗人CD11b抗体10 μL，4℃下避光孵育40 min，阴性对照仅加相应PBS孵育，PBS洗涤一次，加500 μL PBS，用流式细胞仪检测CD11b阳性率。

1.8 统计学分析

实验重复3次，每次设置3个平行样。用SPSS 13.0统计软件对所获得的实验数据统计分析，判断实验结果的统计学意义。各实验组数据均以均数±标准差(x±s)表示，单因素方差分析比较各实验组差异显著性，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 CCK-8法检测LfcinB对Jurkat细胞的抑制作用

检测LfcinB对Jurkat细胞增殖的影响，结果如图1所示。由图1可以看出，当作用时间相同时，随着LfcinB浓度增加，Jurkat细胞的增殖抑制率亦随之增加 (P＜0.01)。此外，随着作用时间的延长，各浓度的Jurkat细胞增殖抑制率也逐渐升高(P＜0.01)。因此表明，LfcinB能显著抑制Jurkat细胞增殖，并具有剂量和时间依赖性。

2.2 LfcinB对Jurkat细胞周期的影响

流式细胞仪检测LfcinB对Jurkat细胞周期分布的影响，结果如图2和图3所示。由图2和图3可以看出，随着LfcinB浓度增加，细胞在G1/G0期百分率明显上升(P＜0.01)，而S期的细胞百分率则显著下降(P＜0.01)，增殖指数也显著下降(P＜0.01)(见图4)，具有剂量依赖性。由此可见，LfcinB可抑制Jurkat细胞增殖并能将其细胞周期阻滞于G1/G0期。

2.3 NBT还原反应检测Lfcin B对Jurkat细胞分化的影响

将Jurkat细胞经不同浓度LfcinB处理，然后检测其NBT还原反应的OD值，结果如图5所示。由图5可以看出，当作用时间相同时，随着LfcinB质量浓度增加，OD值也随之上升(P＜0.01)。此外，随着作用时间的延长，各质量浓度的OD值也随时间的延长而提高(P＜0.01)。该OD值反应细胞的NBT还原能力，亦间接反应细胞的分化程度，因此以上结果说明LfcinB能诱导Jurkat细胞分化，并具有剂量和时间依赖性。

2.4 LfcinB对Jurkat细胞分化抗原CD11b表达的影响

利用流式细胞仪检测药物处理后细胞表面分化抗原CD11b表达水平变化，结果如图6和图7所示。由图6和图7可以看出，随着LfcinB质量浓度增加，Jurkat细胞表面分化抗原CD11b阳性率明显提高 (P＜0.01)，具有剂量依赖性，表明LfcinB诱导Jurkat细胞分化的能力随着浓度提高而增强。

图3 不同质量浓度LfcinB对Jurkat作用48 h后不同时期细胞百分率

图4 不同质量浓度LfcinB对Jurkat细胞增殖指数的影响

图5 不同质量浓度LfcinB对Jurkat细胞分化的影响

图6 不同质量浓度LfcinB对Jurkat细胞表面分化抗原表达的影响

图7 不同质量浓度LfcinB对Jurkat细胞表面分化抗原CD11b阳性率的影响

3 结果与讨论

白血病是造血系统的恶性疾病，俗称“血癌”，是国内十大高发恶性肿瘤之一，严重威胁着人们的健康。恶性增殖是癌细胞一大特点，通过抑制癌细胞无限增殖可起到潜在的预防、治疗癌症的作用。研究发现，口服乳铁蛋白和乳铁蛋白素能提高幼年和成年动物的抗癌、抗炎和抗微生物感染能力[6,7]，而使用乳铁蛋白作用人的乳腺癌细胞可导致癌细胞生长受到抑制[8]，此外人宫颈内膜的致瘤性转化与乳铁蛋白表达下调有关，并伴随着明显的细胞增殖[9]。本研究选用Jurkat T细胞为细胞模型，研究LfcinB对其增殖的影响，发现LfcinB能够明显抑制Jurkat细胞增殖，这与上述结果一致。

细胞周期是指细胞一次有丝分裂完成开始到下一次有丝分裂结束所经历的全过程,包括G1、S、G2和M期。细胞周期失控是细胞异常增殖的重要原因之一，通过阻断细胞周期进程，可导致有丝分裂异常或停滞，使癌细胞无法继续分裂，进而抑制癌细胞的生长。以往研究表明，乳铁蛋白可以通过周期阻滞抑制鼻咽癌、乳腺癌等肿瘤细胞增殖[8,10]。王雷等也研究发现重组人乳铁蛋白可以阻断口腔癌细胞周期进程，诱导G1/G0期阻滞[11]。本研究使用流式细胞仪观察不同浓度LfcinB处理Jurkat细胞后细胞周期分布变化，发现处于G1/G0期的Jurkat细胞蓄积增多，处于S期细胞明显减少，说明DNA合成受阻,细胞不能进入分裂期，肿瘤细胞转向非增殖细胞群。这与Wolf等研究发现乳铁蛋白通过G1/G0期阻滞来抑制肿瘤细胞增殖的结果一致[12]。表明LfcinB可能通过阻滞Jurkat细胞于G1/G0期发挥其增殖抑制效应。

与细胞恶性增殖、凋亡受阻一样，细胞分化异常在恶性肿瘤的发生发展中具有重要意义,白血病的发生就是多能造血干细胞在发育分化的某一阶段分化受阻的结果[13]。如何逆转恶性肿瘤细胞的异常分化是肿瘤研究的重要领域。在细胞分化过程中，细胞表面分化抗原也会相应发生改变，CD11b为Jurkat细胞表面分化抗原，应用单克隆抗体测定细胞表面分化抗原的表达可较精确地判断Jurkat细胞是否发生分化。在许多组织中，细胞由增殖到分化的转化是一个细胞周期阻滞与细胞分化激活相互协调的过程，人们通常认为G1/S期阻滞可能是增殖/分化相互转化的枢纽[14]。本研究中，NBT还原性随着浓度增加而增强，而NBT的还原性也直接反应了细胞分化程度，此外CD11b阳性率随着质量浓度提高增加，表明LfcinB能诱导Jurkat细胞分化，这与肖晖等研究认为乳铁蛋白呈时间和浓度依赖性促进大鼠成骨细胞分化的结果一致[15]。

本研究初步阐明了LfcinB对Jurkat细胞增殖、分化的影响，这为LfcinB抗白血病的研究提供了实验支撑，为乳铁蛋白素保健品的开发应用奠定了理论基础，但其分子机制还有待进一步研究。

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