张鹏　纪亮　沈雷　王玉　李萌　刘琰

[摘要] 目的 观察高糖环境下，锰超氧化物歧化酶（MnSOD）刺激间充质干细胞（MSC）上清液对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）增殖和趋化能力的影响。 方法 高糖MSC培养基条件下，100μg/L MnSOD刺激的MSC为实验组，未刺激的MSC为对照组，添加Akt阻断剂5μmol/L Tricirlbine为Akt阻断剂组，利用各组条件培养基在高糖1640培养基条件下，培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC），使用MTT法观察各条件培养基对HUVEC增殖的影响，并利用细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验对HUVEC的趋化情况进行评估。 结果 与对照组相比，MSC实验组条件培养基促进HUVEC增殖；但是Akt阻断剂组HUVEC增殖能力降低；MSC实验组条件培养基作用的HUVEC趋化活动与对照组相比明显提高，但MSC实验组HUVEC趋化活动在Akt阻断剂组明显被抑制；MSC实验组条件培养基中VEGF含量比对照组明显提高。结论 高糖条件下MnSOD可以通过刺激间充质干细胞旁分泌VEGF等细胞因子对血管内皮细胞增殖、趋化等能力产生影响。

[关键词] 间充质干细胞；锰超氧化物歧化酶；旁分泌；人脐静脉血管内皮细胞

[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）13-0013-03

全球糖尿病患者到2035年将增加5.92亿[1]。高血糖增加活性氧，致使皮肤血管内皮细胞代谢紊乱 [2]。MSC移植到糖尿病足伤口，可以加速伤口愈合[3]，MnSOD在对抗活性氧的过程中发挥重要作用，如果利用MnSOD发挥对MSC的抗高糖损伤作用，将达到促进溃疡区血管新生之目的，促使MSC细胞疗法的广泛临床应用具有重要意义[4]。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和分组

人骨髓间充质干细胞（MSC）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）分别在正常或高糖MSC培养基中培养MSC为对照组，或添加100mmol/L MnSOD为实验组（MnSOD-MSC），添加5μmol/l Tricirlbine为Akt阻断剂组。

提取各组细胞上清液为条件培养基（conditioned medium， CM），分别为MSC对照组、MnSOD-MSC组、Akt阻断剂组条件培养基。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）实验分组按条件培养基而定。

1.2 条件培养基中VEGF、GSHPX、SOD检测

收集各组MSC条件培养基，使用英国Randox公司生产的ELISA试剂盒测定SOD、GSHPX和VEGF的含量。

1.3 细胞划痕试验

HUVEC接种于6孔板，0.1%FBS的RPMI-1640培养基培养24h，1000μL枪头划痕，并添加2mM羟基脲（Sigma），培养24h，采用IPP软件计算划痕面积闭合率。

1.4 Transwell细胞迁移实验

HUVEC用0.1%FBS的RPMI-1640培养基培养24h，以8×103个细胞/孔接种，放置在Transwell细胞小室内，孵箱6h，计算染色的细胞数目（100×）。

1.5 统计学分析

统计学处理采用SPSS18.0软件包，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 间充质干细胞在高糖环境下的增殖

正常MSC对照组的OD值为（0.913±0.344），高糖条件下，MSC对照组、MnSOD-MSC组和Akt阻断剂组的OD值分别为（0.425±0.147）、（1.261±0.579）和（0.635±0.812）。其中正常MSC对照组与高糖条件下MSC对照组、高糖条件下MSC对照组和MnSOD-MSC组、高糖条件下MnSOD-MSC组和Akt阻断剂组OD值比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。

2.2各组CM对HUVEC增殖影响

高糖条件下，MSC对照组、MnSOD-MSC组和Akt阻断剂组CM对HUVEC增殖的OD值分别为（0.824±0.176）、（1.590±0.152）和（1.073±0.294），其中前两组和后两组分别比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。

2.3 各组CM对HUVEC趋化能力的作用

MnSOD-MSC CM组和MSC CM组HUVEC划痕闭合面积分别为（0.26±0.15）μm2、（0.19±0.03）μm2，两者具有显著差异（P<0.01），见图1A、B、G；Akt阻断剂CM组HUVEC划痕闭合面积为（0.17±0.51）cm2，与MnSOD-MSC CM组比较具有显著差异（P<0.01），见图1B、C、G。

MnSOD-MSC CM组和MSC CM组HUVEC迁移数目分别为（1824.85±10.11）、（928. 64±13.24），两者具有显著差异（P<0.01），见图1D、E、H；Akt阻断剂CM组HUVEC迁移数目为（1121.50±21.67），与MnSOD-MSC CM组比较有显著差异（P<0.01），见图1E、F、H。

图1 HUVEC划痕和迁移结果

A-C：各组HUVEC细胞划痕图（40×），图框代表0h划痕面积；D-F：各组CM组HUVEC细胞迁移图（100×）；G：HUVEC划痕统计图，*P<0.01；H：HUVEC迁移统计图，*P<0.01

2.4 各组CM中细胞因子的检测

各组条件培养基中VEGF、GSHPX、SOD的检测，见表1。

表1 各组条件培养基中VEGF、GSHPX、SOD含量（ng/L，n=9，x±s）

3 讨论

血管发生的有关细胞因子和生长因子密切配合，协调统一地参与调节血管生成[5]。糖尿病足主要病理变化为局部微血管、神经的病理变化，并产生大量自由基[2]。糖尿病小鼠皮肤MnSOD等抗氧化酶活性显著降低[5]。虽然MSC有正常抗氧化酶系统，但是糖尿病时的MSC细胞活性降低，其分泌的MnSOD等抗自由基酶类降低，影响MSC生物作用[6]。MnSOD基因转染自身骨髓干细胞可以重建损伤性食管炎内膜修复[7]，提示该基因修饰的MSC能够归巢到糖尿病伤口，加速伤口愈合[8]。

本实验结果表明，高血糖条件下，MnSOD可以促使MSC增殖，发挥了MnSOD的抗自由基保护细胞的作用，抗高糖效果非常明显。MnSOD刺激的MSC改善血管内皮细胞活性，促进血管内皮细胞增殖，并发挥了促使HUVEC迁移等能力，MnSOD刺激的MSC条件培养基中VEGF、SOD等血管活化因子或抗自由基蛋白表达升高，其机制可能是由于在MnSOD的刺激下，通过Akt途径活化MSC，促使MSC旁分泌VEGF、SOD等细胞因子，分泌的SOD等物质保护血管内皮细胞对抗高血糖环境，而产生的VEGF等因子则对血管内皮细胞具有促进成血管的能力，如果将MnSOD刺激的MSC移植到糖尿病足皮肤区域，可以发挥对抗自由基、保护细胞、促进血管新生的重要功能，将明显加速伤口愈合，后续研究我们将会用MnSOD转染的MSC应用于体内糖尿病动物足实验模型，观察MnSOD-MSC对糖尿病足愈合的作用和机制，为MSC临床应用提供研究基础和资料。

[参考文献]

[1] L. Guariguata， DR. Whitingb， I. Hambletonc，et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035 for the IDF Diabetes Atlas[J]. Diabetes Research and Clinical Practice，2013， 27（11）：1345-1352.

[2] Gray SP， Di ME， Okabe J， et al. NADPH oxidase 1 plays a key role in diabetes mellitus-accelerated atherosclerosis[J]. Circulation， 2013，127（18）：1888-1902.

[3] Hodgkinson CP， Gomez JA， Mirotsou M， et al. Genetic engineering of mesenchymal stem cells and its application in human disease therapy[J]. Hum Gene Ther， 2010，21（11）：1513-1526.

[4] He T， Peterson TE， Holmuhamedov EL， et al. Human endothelial progenitor cells tolerate oxidative stress due to intrinsically high expression of manganese superoxide dismutase[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24（11）：2021-2027.

[5] Marrotte EJ， Chen DD， Hakim JS， et al. Manganese superoxide dismutase expression in endothelial progenitor cells accelerates wound healing in diabetic mice[J]. J Clin Invest，2010，120（12）：4207-4219.

[6] Cho KA， Woo SY， Seoh JY， et al. Mesenchymal stem cells restore CCl4-induced liver injury by an antioxidative process[J]. Cell Biol Int， 2012，36（12）：1267-1274.

[7] Niu Y， Epperly MW， Shen H， et al. Intraesophageal MnSOD-plasmid liposome enhances engraftment and self-renewal of bone marrow derived progenitors of esophageal squamous epithelium[J]. Gene Ther， 2008，15（5）：347-356.

[8] Volarevic V， Arsenijevic N， Lukic ML， et al. Concise review： Mesenchymal stem cell treatment of the complications of diabetes mellitus[J]. Stem Cells， 2011，29（1）：5-10.

（收稿日期：2014-02-26）

血管发生的有关细胞因子和生长因子密切配合，协调统一地参与调节血管生成[5]。糖尿病足主要病理变化为局部微血管、神经的病理变化，并产生大量自由基[2]。糖尿病小鼠皮肤MnSOD等抗氧化酶活性显著降低[5]。虽然MSC有正常抗氧化酶系统，但是糖尿病时的MSC细胞活性降低，其分泌的MnSOD等抗自由基酶类降低，影响MSC生物作用[6]。MnSOD基因转染自身骨髓干细胞可以重建损伤性食管炎内膜修复[7]，提示该基因修饰的MSC能够归巢到糖尿病伤口，加速伤口愈合[8]。

本实验结果表明，高血糖条件下，MnSOD可以促使MSC增殖，发挥了MnSOD的抗自由基保护细胞的作用，抗高糖效果非常明显。MnSOD刺激的MSC改善血管内皮细胞活性，促进血管内皮细胞增殖，并发挥了促使HUVEC迁移等能力，MnSOD刺激的MSC条件培养基中VEGF、SOD等血管活化因子或抗自由基蛋白表达升高，其机制可能是由于在MnSOD的刺激下，通过Akt途径活化MSC，促使MSC旁分泌VEGF、SOD等细胞因子，分泌的SOD等物质保护血管内皮细胞对抗高血糖环境，而产生的VEGF等因子则对血管内皮细胞具有促进成血管的能力，如果将MnSOD刺激的MSC移植到糖尿病足皮肤区域，可以发挥对抗自由基、保护细胞、促进血管新生的重要功能，将明显加速伤口愈合，后续研究我们将会用MnSOD转染的MSC应用于体内糖尿病动物足实验模型，观察MnSOD-MSC对糖尿病足愈合的作用和机制，为MSC临床应用提供研究基础和资料。

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（收稿日期：2014-02-26）

血管发生的有关细胞因子和生长因子密切配合，协调统一地参与调节血管生成[5]。糖尿病足主要病理变化为局部微血管、神经的病理变化，并产生大量自由基[2]。糖尿病小鼠皮肤MnSOD等抗氧化酶活性显著降低[5]。虽然MSC有正常抗氧化酶系统，但是糖尿病时的MSC细胞活性降低，其分泌的MnSOD等抗自由基酶类降低，影响MSC生物作用[6]。MnSOD基因转染自身骨髓干细胞可以重建损伤性食管炎内膜修复[7]，提示该基因修饰的MSC能够归巢到糖尿病伤口，加速伤口愈合[8]。

本实验结果表明，高血糖条件下，MnSOD可以促使MSC增殖，发挥了MnSOD的抗自由基保护细胞的作用，抗高糖效果非常明显。MnSOD刺激的MSC改善血管内皮细胞活性，促进血管内皮细胞增殖，并发挥了促使HUVEC迁移等能力，MnSOD刺激的MSC条件培养基中VEGF、SOD等血管活化因子或抗自由基蛋白表达升高，其机制可能是由于在MnSOD的刺激下，通过Akt途径活化MSC，促使MSC旁分泌VEGF、SOD等细胞因子，分泌的SOD等物质保护血管内皮细胞对抗高血糖环境，而产生的VEGF等因子则对血管内皮细胞具有促进成血管的能力，如果将MnSOD刺激的MSC移植到糖尿病足皮肤区域，可以发挥对抗自由基、保护细胞、促进血管新生的重要功能，将明显加速伤口愈合，后续研究我们将会用MnSOD转染的MSC应用于体内糖尿病动物足实验模型，观察MnSOD-MSC对糖尿病足愈合的作用和机制，为MSC临床应用提供研究基础和资料。

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[5] Marrotte EJ， Chen DD， Hakim JS， et al. Manganese superoxide dismutase expression in endothelial progenitor cells accelerates wound healing in diabetic mice[J]. J Clin Invest，2010，120（12）：4207-4219.

[6] Cho KA， Woo SY， Seoh JY， et al. Mesenchymal stem cells restore CCl4-induced liver injury by an antioxidative process[J]. Cell Biol Int， 2012，36（12）：1267-1274.

[7] Niu Y， Epperly MW， Shen H， et al. Intraesophageal MnSOD-plasmid liposome enhances engraftment and self-renewal of bone marrow derived progenitors of esophageal squamous epithelium[J]. Gene Ther， 2008，15（5）：347-356.

[8] Volarevic V， Arsenijevic N， Lukic ML， et al. Concise review： Mesenchymal stem cell treatment of the complications of diabetes mellitus[J]. Stem Cells， 2011，29（1）：5-10.

（收稿日期：2014-02-26）