何启艇　邱波　龚明

[摘要] 目的 比较壳聚糖薄膜培养和常规平板培养对间充质干细胞（MSCs）干性相关基因表达的影响。 方法 从脐带中分离MSCs并分别进行壳聚糖薄膜培养和常规平板培养。采用Real-time RT-PCR和Western blot方法检测MSCs干性相关基因Nanog、Sox2、c-Myc、Oct-4 mRNA及其蛋白的表达。 结果 壳聚糖薄膜培养的MSCs能形成类球状体。壳聚糖薄膜培养的MSCs干性相关基因Nanog、Sox2、c-Myc、Oct-4 mRNA及其蛋白的表达水平较常规培养组显著增加，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 与常规培养的MSCs比较，壳聚糖薄膜培养的MSCs能形成类球状体，更能保持MSCs的干性。

[关键词] 壳聚糖；间充质干细胞；干性；骨关节炎

[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）10（b）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of cultivation modes （chitosan membrane and conventional plate） on the stemness of mesenchymal stem cells （MSCs） by comparing the related genes expression. Methods MSCs were isolated from umbilical cords and cultured on chitosan membrane and conventional plate. mRNA expression concerned with stemness related genes including Nanog， Sox2， c-Myc and Oct-4 were assayed by real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction. Corresponding proteins were detected by Western blot. Results Spheroid was formed by MSCs cultured on chitosan membrane. Compared with MSCs cultured on conventional plate， mRNA and protein expression levels of Nanog， Sox2， c-Myc and Oct-4 increased significantly in chitosan membrane-cultured MSCs， with statistically significant differences （P < 0.01）. Conclusion Compared with conventional culture， chitosan membrane-cultured MSCs can form spheroid， moreover， chitosan membrane can maintain the stemness of MSCs.

[Key words] Chitosan membrane； Mesenchymal stem cells； Stemness； Osteoarthritis

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨退行性变为主要病理特征的疾病，其治疗仍是临床尚未解决的问题。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有多向分化功能。研究发现，MSCs经诱导可以转化为软骨细胞修复关节软骨，对实验性OA具有治疗作用[1-2]。目前体外常规培养（two-dimensional culture，2D培养）不能够维持MSCs的性状稳定，主要表现在MSCs在常规的平板培养过程中发生衰老和向成骨细胞自主分化、增殖能力减退，严重影响了MSCs作为细胞治疗功能的发挥。本文旨在观察壳聚糖薄膜培养对人脐带MSCs干性相关基因表达的作用，探讨壳聚糖薄膜培养对MSCs干性的影响，为进一步探讨壳聚糖薄膜培养的MSCs在OA软骨修复中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 MSCs的培养

本研究得到武汉大学人民医院（以下简称“我院”）伦理委员会同意，取得患者及其家属知情同意并签署知情同意书。脐带来自我院妇产科一分娩后健康产妇。用含100 μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素的PBS（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，中国）充分洗涤脐带。用镊子从脐带的中间分开Wharton′s jelly组织，用剪子剪成小块，在0.1%胶原蛋白酶I型（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）37°C条件下消化16 h，释放MSCs。以300 r/min离心5 min收集MSCs，并在含10%胎牛血清（Hyclone，Victoria，Australia）和10 ng/mL bFGF（Peprotech，London，UK）高糖MEM/F12（Invitrogen）中培养，每3天更换新鲜培养基。当MSCs增殖到80%汇合时，从形态学和流式细胞仪分析鉴定这些细胞为MSCs，以P1代作为种子细胞。

1.2 壳聚糖薄膜的准备

用2%的壳聚糖溶液处理盖玻片，在室温下自然晾干，之后用0.5N NaOH处理2次，再充分用无菌水洗5次，彻底除去NaOH，最后用PBS清洗1次，制备能够培养MSCs的壳聚糖薄膜。

1.3 分组

在壳聚糖薄膜24孔板接种MSCs细胞使其密度分别为100、500、1000 个/cm2，并以同样的细胞密度接种在常规培养细胞板。每3天更换新鲜α-MEM培养基（含10%胎牛血清）。所有细胞均在5% CO2，37°C条件下培养，两者使用的培养基完全相同。

1.4 实时定量RT-PCR（Real-time RT-PCR）检测

采用Real-time RT-PCR检测壳聚糖薄膜和普通平板培养的MSCs细胞干性相关基因的表达。

自P1代获得的MSCs以相同密度接种到壳聚糖薄膜和常规平板培养后72 h，收集MSCs，用RNA提取试剂盒（Invitrogen）提取总RNA，先用逆转录酶试剂盒（TIANSGEN，中国）转录成cDNA，取2 μL cDNA为PCR扩增的模板。用SYBR Green PCR Master Mix （Roche Diagnostics，Basel，Switzerland）在PCR仪（Bio-Rad）定量分析。用GAPDH进行归一化处理，靶基因的表达用mRNA改变与参考基因比较的倍数表示。Real-time RT-PCR引物见表1。

1.5 蛋白印迹法（Western blot）

采用Western blot检测MSCs细胞干性相关基因蛋白的表达。从壳聚糖薄膜和普通平板培养获得的MSCs用预冷的RIPA缓冲液裂解30 min，然后4°C 16 000 r/min离心10 min，收集上清液，用BCA试剂盒（Beyotime）检测总蛋白量。取20 μg总蛋白用10%SDS-PAGE蛋白电泳，转膜到0.22 μm PVDF膜上。用含5%脱脂牛奶的TBST（10 mmol/L Tri-HCl，150 mmol/L NaCl，0.25% Tween-20，pH 7.5）室温下封闭1 h，然后加入多克隆兔抗人Nanog、Sox2、OCT4、c-Myc一抗（所有1∶300稀释，Abcam）孵育过夜。用TBST洗涤后，膜在室温下与羊抗兔IgG-HRP二抗孵育1 h。ECL（Invitrogen）显色，灰度扫描仪进行定量分析，GAPDH作为对照。

1.6 统计学方法

应用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 壳聚糖薄膜培养的MSCs细胞形态学改变

与常规贴壁培养的MSCs相比，壳聚糖薄膜上培养的MSCs起先较为分散，1 d后聚合成小克隆；2 d后形成的克隆增大，呈较为松散的类球体。7 d后消化壳聚糖薄膜上实心紧密的类球体，与培养时间相同的常规平板培养比较，MSCs形态较小。壳聚糖薄膜培养及常规培养对MSCs形态的影响见图1。

2.2 壳聚糖薄膜培养对MSCs干性相关基因Nanog、Sox2、c-Myc和Oct-4 mRNA表达的影响

壳聚糖薄膜培养的MSCs干性相关基因Nanog、Sox2、c-Myc和Oct-4 mRNA的表达水平较常规培养组显著增加，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。

2.3 壳聚糖薄膜培养对MSCs干性相关基因Nanog、Sox2、c-Myc和Oct-4蛋白表达的影响

与常规培养组MSCs干性相关基因Nanog、Sox2、c-Myc和Oct-4蛋白的表达水平比较，壳聚糖薄膜培养组蛋白的表达水平显著增高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图2、表3。

3 讨论

OA的软骨细胞数量减少，只要能使软骨细胞的数量增加并且恢复原有的软骨形态，就能明显改善OA的症状。MSCs是一种具有多向分化潜能和自我复制能力的多潜能未分化细胞，由于易于分离，体外培养的扩增能力、可塑性、免疫抑制特性、自分泌和旁分泌介导的效应、向受伤部位迁徙能力及表型稳定等方面的优势使其成为治疗OA的研究热点[1-4]。研究发现羊OA模型关节腔注射标记的MSCs后，MSCs能分化成软骨细胞并附着于病变软骨部位[5]。关节腔注射MSCs能够抑制骨关节炎软骨退变[6-7]。Saulnier等[2]将MSCs注射到兔OA膝关节内，发现早期治疗能够减轻关节软骨的破坏。OA主要病理特征是关节软骨的损伤，将MSCs移植到病灶处分化成软骨细胞进行软骨修复，具有非常广阔的发展前景[8]。

MSCs作为修复关节软骨的种子细胞，其临床应用必须进行体外MSCs扩增。虽然目前已从多种组织分离提取到MSCs，但体外扩增培养MSCs是关键的一步。常规平板培养（2D培养）不能够维持MSCs的性状稳定，MSCs在传代培养过程中逐渐丧失干细胞特性，表现为衰老，增殖能力下降，向成骨细胞自主分化、迁徙能力显著降低等，严重影响了MSCs作为细胞治疗功能的发挥[9-11]，阻碍了其临床应用。目前的MSCs扩增培养方法使MSCs随着培养传代其干性相关基因的表达下降以至消失，不适当的体外培养条件是引起上述改变的主要原因[12]。采用悬滴培养的三维（three-dimensional，3D）培养环境下MSCs细胞能够形成类球状体，高密度的类球状体提供了细胞生长的微环境，实现了细胞与细胞之间的相互作用。这种形态被认为可以实现对细胞增殖、分化和凋亡等机制调控[13-14]。

壳聚糖是广泛存在于大自然界中的甲壳素衍生物，具有很好的生物相容性、无免疫原性、低毒性的特点，其来源广泛，成本低廉，操作简便。研究发现，利用壳聚糖薄膜培养MSCs能够克服平板培养的缺点，表现为MSCs附在壳聚糖薄膜上可以形成类球状体，类似悬滴培养的3D培养模式，在传代过程中很好地保持了干性，使得其增殖能力提高[15]。MSCs在壳聚糖薄膜上培养能够形成类球状体，其转分化效率显著加强[16-18]。本研究结果也显示MSCs在壳聚糖薄膜上形成类球状体，细胞增殖能力显著提高。

壳聚糖薄膜和附在其上的MSCs相互作用可能提供了更适宜MSCs生长的类似于体内的3D微环境，影响了MSCs细胞骨架最终形成类球状体。研究发现，类球状体的形成与RHO/ROCK激酶通路及细胞膜上CD44相互作用有关，在壳聚糖薄膜上MSCs通过自身表面上的CD44相互作用黏附在一起激活RHO/ROCK激酶通路，并且产生更多的细胞外分子，如层粘连蛋白、纤维连接蛋白等，促进细胞间的黏附、迁徙、细胞骨架重新排列，最终形成类球状体，干性相关基因上调，MSCs增殖能力增强[19]。用CD44抗体阻断CD44受体或者用Y27632混合物阻断RHO/ROCK激酶通路，会导致干性基因的表达受抑制，干性基因下调，干性相关基因的维持与细胞骨架的重排及类球状体的形成有关[20]。本实验结果显示，干性相关基因Nanog、Sox2、c-Myc和Oct-4的表达水平与常规平板培养比较显著增高，表明壳聚糖薄膜上培养的MSCs类球状体的形成较常规平板培养更有助于维持MSCs干性相关基因的表达。是否与上述信号通路的激活相关需进一步研究。

综上所述，与常规平板培养比较，MSCs在壳聚糖薄膜上培养能够形成类球状体，干性相关基因的表达显著上调，表明壳聚糖薄膜培养的MSCs在传代过程中更好地保持了干性。

[参考文献]

[1] Delling U，Brehm W，Ludewig E，et al. Longitudinal evaluation of effects of intraarticular mesenchymal stromal cell administration for the treatment of osteoarthritis in an ovine model [J]. Cell Transplant，2015，24（11）：2391-2407.

[2] Saulnier N，Viguier E，Perrier-Groult E，et al. Intra-articular administration of xenogeneic neonatal Mesenchymal Stromal Cells early after meniscal injury down-regulates metalloproteinase gene expression in synovium and prevents cartilage degradation in a rabbit model of osteoarthritis [J]. Osteoarthritis Cartilage，2015，23（1）：122-133.

[3] Caldwell KL，Wang J. Cell-based articular cartilage repair：the link between development and regeneration [J]. Osteoarthritis Cartilage，2015，23（3）：351-362.

[4] 赵培庆，王连庆，李涛.间充质干细胞成骨分化过程中长链非编码RNA调控作用研究进展[J].中国医药导报，2015， 12（18）：35-38.

[5] Delling U，Brehm W，Metzger M，et al. In vivo tracking and fate of intra-articularly injected superparamagnetic iron oxide particle-labeled multipotent stromal cells in an ovine model of osteoarthritis [J]. Cell Transplant，2015，24（11）：2379-2390.

[6] Chen K，Man C，Zhang B，et al. Effect of in vitro chondrogenic differentiation of autologous mesenchymal stem cells on cartilage and subchondral cancellous bone repair in osteoarthritis of temporomandibular joint [J]. Int J Oral Maxillofac Surg，2013，42（2）：240-248.

[7] Freitag J，Dan B，Boyd R，et al. Mesenchymal stem cell therapy in the treatment of osteoarthritis：reparative pathways，safety and efficacy-a review [J]. Bmc Musculoskeletal Disorders，2016，17（1）：1-13.

[8] Yiying QI，Chen G，Feng G. Osteoarthritis prevention and meniscus regeneration induced by transplantation of mesenchymal stem cell sheet in a rat meniscal defect model [J]. Experimental & Therapeutic Medicine，2016，12（1）：95-100.

[9] Phermthai T，Suksompong S，Tirawanchai N，et al. Epigenetic analysis and suitability of amniotic fluid stem cells for research and therapeutic purposes [J]. Stem Cells Dev，2013， 22（9）：1319-1328.

[10] Redaelli S，Bentivegna A，Foudah D，et al. From cytogenomic to epigenomic profiles：monitoring the biologic behavior of in vitro cultured human bone marrow mesenchymal stem cells [J]. Stem Cell Res Ther，2012，3（6）：47.

[11] Faghihi F，Mirzaei E，Ai J，et al. Differentiation Potential of Human Chorion-Derived Mesenchymal Stem Cells into Motor Neuron-Like Cells in Two- and Three-Dimensional Culture Systems [J]. Mol Neurobiol，2016， 53（3）：1862–1872.

[12] Frith JE，Thomson B，Genever PG. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential [J]. Tissue Eng Part C Methods，2010，16（4）：735-749.

[13] Wang W，Itaka K，Ohba S，et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells [J]. Biomaterials，2009，30（14）：2705-2715.

[14] Liu BH，Yeh HY，Lin YC，et al. Spheroid Formation and Enhanced Cardiomyogenic Potential of Adipose-Derived Stem Cells Grown on Chitosan [J]. Bioresearch Open Access，2013，2（1）：28-39.

[15] Huang YJ，Hsu SH. Acquisition of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem-like phenotypes within chitosan-hyaluronan membrane-derived 3D tumor spheroids [J]. Biomaterials，2014，35（38）：10070–10079.

[16] Cheng N，Wang S，Young T. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities [J]. Biomaterials，2012，33（6）：1748-1758.

[17] Yang CM，Huang YJ，Hsu SH. Enhanced autophagy of adipose-derived stem cells grown on chitosan substrates [J]. Bioresearch Open Access，2015，4（1）：89-96.

[18] Liu BH，Hsi-Yi Y，Lin YC，et al. Spheroid formation and enhanced cardiomyogenic potential of adipose-derived stem cells grown on chitosan [J]. Bioresearch Open Access，2013，2（1）：28-39.

[19] Cheng NC，Wang S，Young TH. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities [J]. Biomaterials，2012，33（6）：1748-1758.

[20] Huang GS，Dai LG，Yen BL，et al. Spheroid formation of mesenchymal stem cells on chitosan and chitosan-hyaluronan membranes [J]. Biomaterials，2011，32（29）：6929-6945.

（收稿日期：2016-06-30 本文编辑：程 铭）