张园园

(安康市农业科学研究所，陕西 安康 725021)

蛹虫草栽培中几种细菌性病原菌分离与鉴定*

张园园

(安康市农业科学研究所，陕西 安康 725021)

利用16S rDNA序列分析的方法，结合细菌形态特征及细菌生理生化鉴定，研究了蛹虫草栽培过程中易导致病害的3种细菌。结果表明，病原菌株E1与Flavobacteriumchungangense，E2与Flavobacteriumchungangense，E3与Janthinobacteriumlividum的进化距离较小，同源性较高，初步确定分别与其同种。这对蛹虫草常见病害的防治研究具有重要的指导意义。

蛹虫草；细菌性病原菌；分离；鉴定

蛹虫草(Cordycepsmilitaris)，又名北冬虫夏草，简称北虫草，属于子囊菌亚门(Ascomycotina)、核菌纲(Pyrenomycetes)、麦角菌目(Clavicipitales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、虫草属(Cordyceps)真菌，与冬虫夏草(Cordycepssineisis)同属异种，具有很高的营养价值和药用价值[1]。大量研究表明，蛹虫草中所含的活性成分虫草素、虫草酸、虫草多糖等含量明显高于冬虫夏草，对提高人体免疫力，预防和治疗高血糖、高血压等多种疾病有显著的作用[2]。因此，对蛹虫草的开发研究越来越受到人们的重视。近年来，随着对蛹虫草的深入研究，蛹虫草栽培技术已日趋成熟，但在生产中仍会出现菌丝生长缓慢、子座分化不整齐或不分化及培养基有黏稠状液体等现象，对蛹虫草产量影响较大。因此，本试验就引起以上现象的病原菌进行分离与鉴定，以期为蛹虫草常见病害的防治研究提供依据，也为完善蛹虫草的栽培技术提供参考。

1 材料

1.1 样品采集

分别采集在蛹虫草栽培过程中被细菌污染的样品4份。

1.2 培养基

细菌培养基(固体)：牛肉膏5 g、蛋白胨5 g、氯化钠3 g、琼脂粉12 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0。

细菌培养基(液体)：牛肉膏5 g、蛋白胨5 g、氯化钠3 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0。

1.3 方法

1.3.1 菌种分离纯化

采用平板稀释涂布法，对样品进行分离纯化。将4份样品分别加入装有100 mL无菌水的三角瓶中，在30℃、200 r·min-1的条件下震荡10 min，按10倍梯度稀释法得到10-6倍～10-8倍稀释液。各取0.5 mL稀释液均匀涂布于平板上，每个梯度重复3次，将平板置于(25±1)℃条件下倒置培养，待平板长出菌落后，分别挑取单菌落进行划线分离纯化，直至获得纯的菌种，4℃保存待用。

1.3.2 致病性测定

将已分离纯化的3个细菌菌株，分别挑取一环细菌置于细菌液体培养基中，30℃培养24 h，制备3种细菌悬浮液。当蛹虫草菌丝覆面后，分别接种细菌悬浮液10 mL·盒-1，设置无菌水对照。接种后进行常规管理，并观察蛹虫草生长情况。

1.3.3 菌落形态观察

将分离到的细菌菌株分别置于(28±2)℃的培养箱中培养，观察菌落特征，并进行简单的染色镜检，观察菌体形态。

1.3.4 细菌生理生化鉴定

挑取细菌菌落，接种生化管，培养24 h～48 h，观察分离菌株的生化特性。检测项目包括甲基红试验、淀粉水解试验、吲哚试验、明胶液化试验、接触酶试验、运动性试验。

1.3.5 菌株分子生物学鉴定

采用16S rDNA法对细菌进行分子生物学鉴定[3]。首先，采用快速微量提取法提取细菌基因组DNA，并将各菌株的DNA溶解于50 μL的TE中，-20℃保存备用；其次，采用细菌通用引物27F和1492R进行扩增，正向引物：27F(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)，反向引物：1492R(5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)。PCR反应体系(50 μL) 27F 2 μL，1492R 2 μL，ExTaq 0.4 μL，2×Reaction mix 25 μL，ddH2O20.6 μL，DNA 2 μL。PCR反应条件：95℃预变性3 min，然后95℃变性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸90 s，30个循环，最后72℃延伸10 min；PCR产物经电泳检测后，由上海桑尼生物科技有限公司进行测序；将各个菌株基因序列运用Blast程序与GenBank中已存在的菌株核酸序列进行比较，选取相似性较高的序列进行分析，使用MEGA5软件中的BootstrapTest of Phylogeny-Neighbor Joining法构建系统发育树[4]，并参照菌株的形态特征和生理生化检测结果，结合常见细菌系统鉴定手册[5]，初步鉴定菌株的种属。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化与保藏

根据形态特征从样品中分离到3种菌株，分别编号为E1～E3。

2.2 致病性测定

致病性测定结果表明，在菌丝覆面后，重新接种3种不同的菌悬液，48 h后菌丝均表现出生长缓慢的现象。培养36 h后对其进行光照，结果如图1～图4所示。

图1～图4表明，菌株E1～E3均可不同程度地抑制蛹虫草菌丝生长，导致菌丝生长缓慢、无法正常转色并形成原基，最终出现菌丝老化并自溶的现象。

2.3 菌株形态观察

不同菌株菌落形态观察结果见表1。

2.4 细菌生理生化鉴定

细菌E1～E3的生理生化鉴定结果见表2。

2.5 菌株PCR扩增产物

采用原核生物16S rDNA序列的通用引物27F、1492R对3株细菌基因组DNA进行PCR扩增，产物的琼脂糖凝胶电泳

表1 菌落形态观察

结果表明，在1 500 bp处有3条DNA带，表明分离的菌株均为原核生物类。

表2 细菌的生理生化鉴定结果

注：+表示阳性，-表示阴性。

2.6 序列比对和进化树的构建

使用NCBI网站，将E1～E3的序列与数据库中各个菌株的序列进行比对，并选取相似性较高的序列构建进化树，结果见表3～表5和图5～图7。

2.6.1 E1菌株Blast比对结果及系统发育分析

GenBank 上E1的部分相似菌株及E2系统进化发育树见表3、图5。

表3 GenBank上E1的部分相似菌株

由表3可见，E1与Flavobacteriumchungangense的同源性最高，达98%；从图5可以看出，E1与Flavobacteriumchungangense聚为一支，与其他菌株的差异相对较大。因此，综合Blast和进化发育树的结果，初步确定E1与Flavobacteriumchungangense为同种。

2.6.2 E2菌株Blast比对结果及系统发育分析

GenBank上E2的部分相似菌株及E2系统进化发育树见表4、图6。

表4 GenBank上E2的部分相似菌株

由表4可见，E2与Pseudomonasasplenii的同源性最高，达100%；从图6上可以看出，E2与Pseudomonasasplenii聚为一支，与其他菌株的差异相对较大。因此，综合Blast和进化发育树的结果，初步确定E2与Pseudomonasasplenii为同种。

2.6.3 E3菌株Blast比对结果及系统发育分析

GenBank上E3的部分相似菌株及E3系统进化发育树见表5、图7。

表5 GenBank 上E3的部分相似菌株

由表5可见，E3与Janthinobacteriumlividum的同源性最高，达99%；从图7上可以看出，E3与Janthinobacteriumlividum聚为一支，与其他菌株的差异相对较大。因此，综合Blast和进化发育树的结果，初步确定E3与Janthinobacteriumlividum为同种。

3 结论与讨论

本研究利用细菌的通用引物，提取各菌株的总DNA，采用PCR方法扩增得到各菌株的序列。一般认为，若同源性大于99%，则可认为它们属同一个种；若同源性小于98%，可认为属不同的种；同源性小于95%，可认为属不同的属[6]。综合各菌株形态特征、生理生化特性及进化发育树，参考常见细菌系统鉴定手册和真菌鉴定手册，初步确定E1为Flavobacteriumchungangense，E2为Pseudomonasasplenii，E3为Janthinobacteriumlividum。根据这些菌株的特征，可从筛选抗病菌株、研制抑制剂等方面对蛹虫草栽培中的病害进行防治研究，这也为完善蛹虫草栽培技术提供了重要依据。

[1]卯晓岚. 我国常见食药用菌名称[J]. 中国食用菌，2002，21(4)：24-26.

[2]张平，朱述钧，钱大顺，等. 北冬虫夏草功能成分及保健作用分析[J]. 江苏农业科学，2003(6)：105-107.

[3]魏群. 分子生物学试验指导(第二版)[M]. 北京：高等教育出版社，2007.

[4]奥斯伯，金斯顿，塞德曼，等. 精编分子生物学实验指南[M]. 北京：科学出版社，2001.

[5]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[6]Tejada AM, Garcia C, Gonzalez JL, et al. Use of organic amendment as a strategy for soil remediation: Influence on the physical, chemicial and biological properties of soil[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2006(38): 1413-1421.

Isolation and Identification of Several Kinds of Bacterial Pathogens inCordycepsmilitarisCultivation

ZHANG Yuan-yuan

(Agricultural and Science Research Institute of Ankang City, AnkangShanxi725021)

Using sequence analysis method of 16S rDNA, combining with morphological characteristics of bacterial, as well as, physiological and biochemical identification of bacteria, three bacterial, which caused disease in the cultivation ofCordycepsmilitariswere studied. The results showed that E1～E3 had high similarity withFlavobacteriumchungangense,Flavobacteriumchungangense,Janthinobacteriumlividum, respectively and speculated that it may be for their relatives. It had important guiding significance in preventing and controlling common disease on artificial cultivation ofCordycepsmilitaris.

Cordycepsmilitaris; Bacterial pathogens; Separation; Identification

*项目来源：陕西省农业厅农业科技示范项目“秦巴山区特色食用菌产业关键技术研究”(2011KTCL02-18)。

张园园(1987-)，女，助理农艺师，主要研究方向为秦巴山区野生珍稀食、药用菌人工驯化栽培及富硒产品开发研究。 E-mail: zhangyuanyuan405@163.com

2014-09-22

S646.9

A

1003-8310(2014)06-0046-04