孙立亭 赵志强 田凤石

吡格列酮对胰岛素抵抗OLETF大鼠血清IL-18、TLR4表达的影响

孙立亭1赵志强2田凤石3△

目的 研究吡格列酮对胰岛素抵抗(IR)自发性持续高血糖（OLETF）大鼠血清白细胞介素（IL）-18和Toll样受体4（TLR4）表达的影响及其降低心血管疾病风险的可能机制。方法OLETF大鼠24只，高脂喂养20周建立IR模型，后随机均分为模型（M）组和吡格列酮(P)组，M组继续给予高脂饲料，P组给予吡格列酮加高脂饲料。另择LETO大鼠12只为正常对照(NC)组，给予标准饲料。药物干预20周后测定各组大鼠血清胰岛素（FINS）、空腹血糖（FBG）、IR指数（HOMA-IR）、胰岛素敏感指数（ISI）、三酰甘油(TG)、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、IL-18、TLR4水平。结果24只OLETF大鼠均造模成功。M组FBG、FINS、HOMAIR、TC、TG、LDL-C、IL-18和TLR4均高于NC组和P组，ISI、HDL-C均低于NC组和P组（均P＜0.05）。血清IL-18与FBG、FINS、HOMA-IR、TLR4呈正相关，与ISI呈负相关。血清TLR4与FBG、FINS、HOMA-IR、IL-18呈正相关，与ISI呈负相关（均P＜0.05）。多元Logistic回归分析结果显示IL-18、TLR4是HOMA-IR的影响因素。结论吡格列酮可改善OLETF大鼠的IR及炎症状态，其可能通过降低IL-18水平和抑制TLR4途径发挥抗炎作用，从而降低心血管疾病的发生风险。

胰岛素抵抗；白细胞介素18；Toll样受体4；心血管疾病；大鼠,近交OLETF；吡格列酮

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR-γ）激动 剂罗格列酮在改善胰岛素抵抗（IR）及降低血糖等方面的疗效确切，但有研究表明罗格列酮可能无助于降低糖尿病患者心血管疾病的风险，反而会增加心肌梗死、心衰等心血管事件的发生率[1-2]。而Ciudin等[3]研究显示，同为PPAR-γ激动剂的吡格列酮可使高风险患者的心血管事件的发生率降低19%，罗格列酮可使缺血性心血管事件增加1.8倍，心肌梗死的风险增加43%[4]。本研究通过建立自发性持续高血糖（otsuka long-evans tokushima fatty，OLETF）大鼠IR模型，并用吡格列酮进行干预，进一步探讨吡格列酮改善IR、降低心血管疾病风险的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）动物。4周龄SPF级雄性OLETF大鼠24只，同品系long-evans tokushima fatty(LETO)大鼠12只，体质量140～190 g，均购自日本大冢制药公司研究所。（2）饲料。大鼠高脂饲料、标准饲料均购自中国医学科学院放射医学研究所。（3）主要仪器与试剂。大鼠白细胞介素（IL）-18、Toll样受体4（Toll like receptor 4,TLR4）ELISA试剂购自武汉华美生物技术有限公司，批号分别为CSB-EO4610r、CSB-E15822r；全自动生化分析仪（德国SWA公司）。

1.2 方法

1.2.1 饲养与分组 参照文献[5]建立IR模型。24只OLETF大鼠（高脂组）以高脂饲料喂养20周后，采用随机数字表法分为2组：模型（M）组12只，继续给予高脂饲料；吡格列酮（P）组12只，给予高脂饲料加吡格列酮2mg/（kg·d），干预20周。另12只LETO大鼠为正常对照（NC）组，以标准饲料喂养。

1.2.2 指标检测 高脂饲料喂养20周后，禁食12 h，采用葡萄糖酶法测定空腹血糖（FBG），放射免疫法测定血清胰岛素（FINS），并计算IR指数[HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5]及胰岛素敏感指数[ISI=Ln1(FBG×FINS)]，判断是否成功建立IR模型。药物干预20周后，禁食12 h，再次测定FBG、FINS、HOMA-IR和ISI。并取空腹股动脉血5 mL，离心分装后于-20℃储存备用。采用全自动生化分析仪测定三酰甘油(TG)、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。采用双抗体夹心ELISA法测定IL-18、TLR4，严格按照说明书操作。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计处理，计量资料以±s表示，2组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），进一步组间多重比较采用LSD-t检验；相关分析采用Pearson相关；HOMA-IR的影响因素采用多元Logistic回归分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OLETF大鼠IR模型的建立 高脂喂养20周后，高脂组FBG、FINS和HOMA-IR均明显高于NC组，ISI低于NC组（均P＜0.01），见表1，表明成功建立IR模型[6]。

2.2 各组FBG、FINS、HOMA-IR、ISI的比较 干预后M组FBG、FINS和HOMA-IR均明显高于NC组和P组，ISI均低于NC组和P组（均P＜0.05），见表2。

Table 1 Comparison of levels of FBG,FINS,HOMA-IR and ISI between NC group and high-fat diet feeding group表1NC组与高脂组FBG、FINS、HOMA-IR及ISI比较 （±s）

Table 1 Comparison of levels of FBG,FINS,HOMA-IR and ISI between NC group and high-fat diet feeding group表1NC组与高脂组FBG、FINS、HOMA-IR及ISI比较 （±s）

＊＊P＜0.01

组别NC组高脂组t n 12 24 FBG (mmol/L) 5.46±0.41 6.67±0.54 10.198＊＊FINS (mmol/L) 15.61±0.41 20.36±1.56 11.798＊＊HOMA-IR 3.79±0.35 6.24±0.48 15.499＊＊ISI -4.44±0.09 -4.94±0.07 17.133＊＊

Table 2 Comparison of levels of FBG,FINS,HOMA-IR and ISI between every group表2各组间FBG、FINS、HOMA-IR及ISI的比较（±s）

Table 2 Comparison of levels of FBG,FINS,HOMA-IR and ISI between every group表2各组间FBG、FINS、HOMA-IR及ISI的比较（±s）

＊＊P＜0.01；a与M组比较，P＜0.05

组别NC组M组P组F n 12 12 12 FBG (mmol/L) 5.75±0.29a13.67±2.14 10.40±1.26a55.406＊＊FINS (mmol/L) 15.51±0.53a24.53±4.49 20.54±1.14a16.745＊＊HOMA-IR 3.96±0.21a14.87±3.31 9.50±1.29a46.129＊＊ISI -4.46±0.08a-6.03±0.08 -5.38±0.15a12.714＊＊

2.3 各组血脂水平的比较 干预后M组TC、TG和LDL-C均明显高于NC组和P组，HDL-C均低于NC组和P组（均P＜0.05），见表3。

Table 3 Comparison of levels of TC,TG,HDL-C,LDLC between every group表3各组间TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的比较（±s）

Table 3 Comparison of levels of TC,TG,HDL-C,LDLC between every group表3各组间TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的比较（±s）

＊＊P＜0.01；a与M组比较，P＜0.05

组别NC组M组P组F n 12 12 12 TC (mmol/L) 2.61±0.14a3.50±0.18 2.65±0.29a32.619＊＊TG (mmol/L) 1.35±0.13a1.65±0.10 1.44±0.69a10.554＊＊HDL-C (mmol/L) 2.38±0.13a2.05±0.12 2.26±0.07a8.510＊＊LDL-C (mmol/L) 0.82±0.12a1.68±0.15 0.96±0.11a49.853＊＊

2.4 各组血清IL-18、TLR4水平的比较 干预后，M组IL-18、TLR4均高于NC组和P组（均P＜0.05），见表4。

2.5 IL-18、TLR4与其他指标的相关性分析 血清IL-18与FBG、FINS、HOMA-IR、TLR4呈正相关，与ISI呈负相关。血清TLR4与FBG、FINS、HOMA-IR呈正相关，与ISI呈负相关（均P＜0.05），见表5。

2.6 多因素Logistic回归分析 以HOMA-IR为因变量，以FBG、FINS、TG、TC、HDL-C、LDL-C、IL-18、TLR4为自变量，进行多因素Logistic回归分析，结果显示IL-18、TLR4是HOMA-IR的影响因素，见表6。

Table 4 Comparison of levels of serum IL-18, TLR4between every group表4 各组间血清IL-18、TLR4水平的比较（±s）

Table 4 Comparison of levels of serum IL-18, TLR4between every group表4 各组间血清IL-18、TLR4水平的比较（±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01；a与M组比较，P＜0.05

组别NC组M组P组F n 12 12 12 IL-18 (ng/L) 0.28±0.007a0.31±0.034 0.29±0.014a4.688＊TLR4 (ng/L) 2.12±0.39a7.02±4.43 2.53±1.35a19.615＊＊

Table 5 Correlation analysis between IL-18,TLR4 and other indicators表5 IL-18、TLR4与其他指标的Pearson相关性分析（r）

Table 6 The multinomal Logistic regression of influential factors of HOMA-IR表6 HOMA-IR影响因素的多因素Logistic回归分析

3 讨论

吡格列酮作为新一代的PPAR-γ激动剂，其保护血管内皮功能、抗心肌缺血再灌注损伤等作用正日益受到关注。王浩等[7]研究发现，吡格列酮可通过减少核因子(NF)-κB激活而上调转化生长因子（TGF)β1的表达，从而发挥抗心肌细胞凋亡的作用。吴艳霞等[8]研究发现，吡格列酮可通过调节内皮素-1（ET-1）和TNF-α而发挥氧化应激和抗炎的作用，减少心肌梗死面积，改善左室功能。朱亭等[9]研究还发现，吡格列酮能降低肥胖伴T2DM患者炎症因子C反应蛋白（CRP）、IL-6、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的水平，具有显著的抗炎作用。

IL-18是继TNF-α、IL-6之后发现的又一作用强大的前炎性细胞因子，在炎症级联反应中居中心地位，它能刺激TNF-α和IL-6的合成，参与IR、动脉粥样硬化斑块的发生、发展。李巧汶等[10]研究还发现IL-18可能通过诱导斑块内细胞凋亡而促进易损斑块的形成，导致急性冠脉综合征的发生。本研究结果显示，吡格列酮干预20周后，P组IL-18明显低于M组，提示吡格列酮可能通过降低OLETF大鼠血清IL-18的水平而发挥抗动脉硬化、稳定斑块的作用。

TLR4是人类发现的第一个TLR相关蛋白，TLR4介导的NF-κB信号转导通路能促进大量炎性因子TNF-α、IL-1等的产生，在心血管疾病的发展过程中起着十分重要的作用。Eissler等[11]研究发现，自发性高血压大鼠TLR4的表达较对照组明显增强，提示TLR4介导的炎性反应可能参与了高血压的发生。康晓敏等[12]对血管紧张素Ⅱ所致高血压小鼠的研究中发现，注射TLR4中和抗体后，小鼠血压下降，ET-1表达明显下调，表明注射TLR4中和抗体可以抑制血管紧张素Ⅱ所致的高血压小鼠血管内皮收缩功能的损害，下调血管平滑肌增殖细胞核抗原（PCNA）的表达，这为TLR4参与血管紧张素所致的高血压小鼠血管重构提供了直接的证据。Kashiwagi等[13]研究发现，在急性心肌梗死的患者中，TLR4的表达水平明显升高，Riad等[14]对小鼠心肌梗死后6 d进行相关指标检测，发现TLR4基因敲除小鼠的心功能较普通小鼠高，而心肌重构程度、心房利钠肽、心肌总胶原蛋白的量以及心脏质量与体质量的比值均低于对照小鼠，这说明TLR4对心肌梗死后心肌重构起促进作用。

本研究通过建立IR大鼠模型，用吡格列酮干预后发现，P组血清TLR4的水平明显降低，提示吡格列酮可能通过降低TLR4的表达，抑制其所介导的炎性通路，从而起到改善IR及动脉粥样硬化、稳定动脉硬化斑块的作用，而且还可减轻炎性反应所造成的心肌纤维化及心肌重构。随着对TLR4研究的逐渐深入，TLR4所介导的免疫炎症途径可能成为心血管疾病新的干预治疗靶点。吡格列酮通过抑制TLR4途径及降低IL-18水平所发挥的抗炎作用，提示对于MS或糖尿病的患者，在常规治疗的基础上加用吡格列酮，可能会显著降低其发生心血管疾病的风险。

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[8]吴艳霞，吴婷玉，李秀娟，等.吡格列酮对急性心肌梗死左室功能和心肌细胞凋亡的影响[J].临床心血管杂志，2013,29(3):227-229.

[9] 朱亭，邓月珍，叶飞，等.吡格列酮对肥胖2型糖尿病患者炎症因子的影响[J].现代医学，2013,41(1):23-25.

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[12]康晓敏,吕宏娟,王霞,等.Toll样受体4在血管紧张素Ⅱ所致高血压小鼠血管重构中的作用[J].中华老年新脑血管病杂志,2013,15 (1):67-70.

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（2014-02-01收稿 2014-03-04修回）

（本文编辑 陈丽洁）

Effect of Pioglitazone on Interleukin-18 and Toll-Like Receptor 4 Expression in OLETF Rats with Insulin Resistance

SUN Liting1,ZHAO Zhiqiang2,TIAN Fengshi3
1 Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2 Second Hospital of Tianjin Medical University; 3 The Fourth Center Hospital of Tianjin

Objective To investigate change of TLR4 in OLETF(Otsuka Long-Evans Tokushima fatty)rats with insulin resistance(IR),and to study the effect of pioglitazone(PIO)on the expression of TLR4,and to explore the possible mechanisms of the PIO reducing the risk of cardiovascular diseases.MethodsTwenty four OLETF rats were fed with highfat diet for 20 weeks to establish the IR model then they were randomly assigned into two groups:the model group(group M), in which the rats were fed with high-fat diet;the PIO group(group P),in which the rats were fed with PIO in addition to highfat diet.Control group include 12 OLETF rats fed with normal diet(group NC).After 20 weeks of drug intervention,plasma levels of FINS(Fasting INSulin),FBG(Fasting Blood Glucose),blood lipid,IL-18 and TLR4 were assessed in every group.ResultsComparing with group NC,FBG,Blood lipid,IL-18 and TLR4 were significantly increased in group M（P＜0.05 or P＜0.01）,comparing with group M,FBG,Blood lipid were improved in group P,and serum IL-18,TLR4 were significantly lower in the group P than that in group M（P＜0.05 or P＜0.01）.ConclusionTLR4 may be involved in IR by promoting inflammatory response,and PIO can significantly improve IR and inflammatory,and reduce the risk of cardiovascular diseases by inhibiting the expression of TLR4.

insulin resistance;interleukin-18;toll-like receptor 4;cardiovascular diseases;rats,inbred OLETF;pioglitazone

R587.1,R54

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.016

1天津医科大学研究生院（邮编300070）；2天津医科大学第二医院；3天津市第四中心医院

△通讯作者 E-mail:fengshitian0801@hotmail.com