贺晓玉

运动训练对脊髓损伤大鼠脊髓内BDNF及其受体TrkB表达的影响*

贺晓玉△

目的 研究运动训练对脊髓损伤（SCI）大鼠脊髓内脑源性神经营养因子（BDNF）及其酪氨酸激酶受体B（TrkB）表达的影响。方法24只SD大鼠随机均分为假手术组、损伤对照组和运动训练组。采用通用型脊髓打击器建立T10 SCI大鼠模型。运动训练组于损伤后1周起对大鼠进行4周运动训练，假手术组和损伤对照组不进行运动训练。采用BBB评分观察损伤前及损伤后第1～5周大鼠后肢运动功能的变化。运动训练结束后取大鼠T12～L1节段脊髓，免疫组化结合图像平均光密度分析观察脊髓组织BDNF和TrkB的表达及分布，Western blot检测脊髓内BDNF和TrkB蛋白含量。结果损伤前，3组大鼠BBB评分为21.00分。损伤后，损伤对照组及运动训练组BBB评分均低于假手术组（均P＜0.05）。损伤3周后运动训练组BBB评分高于损伤对照组（P＜0.05）。BDNF、TrkB免疫反应阳性产物均多分布于脊髓前角、脊髓后角及中央管周围；运动训练组BDNF、TrkB阳性染色颗粒均增多，平均光密度值均高于假手术组和损伤对照组（均P＜0.05）。运动训练组大鼠脊髓内BDNF及TrkB的表达高于假手术组和损伤对照组。结论运动训练能诱导SCI大鼠脊髓内BDNF及其受体TrkB表达，促进其运动功能恢复。

脊髓损伤；运动疗法；脑源性神经营养因子；受体，trkB；免疫组织化学；印迹法，蛋白质；运动训练

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种主要由外伤引起的目前几乎不可治愈的致残性伤害，SCI患者常伴有严重的运动和感觉功能障碍。运动训练作为康复治疗的一种重要手段，广泛用于现阶段脊髓损伤的康复治疗，其临床疗效为大量研究所认可[1]。但运动训练促进脊髓损伤修复的作用机制仍不十分清楚。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)是一种保护性的神经营养因子，对多种神经元的发育分化和生长再生具有维持和促进作用，能挽救损伤脊髓运动和感觉神经元[2]。本研究在建立SCI大鼠模型基础上，观察运动训练对SCI大鼠损伤脊髓内BDNF及其酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)蛋白表达的影响，探讨运动训练促进脊髓损伤修复的作用机制，为脊髓损伤的康复治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级成年雌性SD大鼠24只，体质量（227±25）g，购自南方医科大学动物中心。采用完全随机法将其分为假手术组、损伤对照组(损伤后不训练)和运动训练组(术后1周开始训练，共4周)，每组8只。

1.2 实验仪器及试剂 通用型脊髓打击器(SS-Ⅱ型)由中山大学脊髓损伤研究所提供。滚筒式网状训练器及跑步训练器购自杭州段氏制造。兔抗鼠BDNF一抗购自武汉博士德生物工程有限公司；兔抗鼠TrkB一抗、加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自CST公司；PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒购自美国GBI公司，DAB显色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 SCI模型制作 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，切除T10椎板，暴露脊髓。通用型脊髓打击器10 g重锤自4 cm高度处自由下落，制成T10段SCI模型[3]。围手术期肌内注射青霉素20万IU/kg预防感染，连续3 d；并定时进行膀胱按摩，协助排便。

1.3.2 运动训练 运动训练于脊髓损伤后1周开始，包括滚筒式网状训练和减重平板训练。滚筒训练：将大鼠置于转速为5 r/min的网状滚筒训练器中，大鼠在滚筒训练器内进行抓握、攀爬等运动训练。减重平板训练采用跑步机及减重装置。跑台速度为0.8 km/h。减质量为体质量的20%～40%(随时间延长逐渐降低减质量程度，第1周减质量40%，第2周35%，第3周30%，第4周20%)。每天运动训练2次，每次10 min，每周连续训练5 d，共训练4周。假手术组和损伤对照组置于笼内不进行运动训练。

1.3.3 Basso、Beattie、Bresnahan(BBB)运动功能评分 将大鼠放入一固定场所，观察大鼠后肢运动、躯干位置及稳定性、步态协调性、爪的位置、足趾间隙及尾的位置等变化，采用BBB行为功能评定量表评定大鼠后肢运动功能。完全截瘫为0分，正常为21分。于损伤前及损伤后1、2、3、4、5周，由两名熟悉BBB评分标准的非本研究人员同时进行盲法评分，取平均值。

1.3.4 免疫组化检测 运动训练结束后，10%水合氯醛腹腔内注射麻醉，4%多聚甲醛心脏灌注固定，取大鼠T12～L1节段脊髓，经固定、脱水、透明、石蜡包埋、切片。免疫组化结合图像平均光密度分析观察脊髓组织BDNF和TrkB的表达及分布情况。按试剂盒说明进行免疫组化二步法染色，应用图像分析系统测定BDNF和TrkB免疫组化染色平均光密度值。

1.3.5 Western blot检测 取脊髓组织充分研磨，抽提蛋白，取蛋白上样液，经10%SDS凝胶电泳分离，转移蛋白至PVDF印迹膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST封闭非特异性免疫反应结合位点，用BDNF、TrkB一抗4℃孵育过夜，TBST漂洗3次后加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次。在ECL发光反应系统中反应5 min，暗室压片1 min，胶片显影。以兔抗GAPDH抗体和山羊抗兔IgG抗体为一抗和二抗，重复上述步骤作为内参照。

1.4 统计学方法 采用IBM SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组BBB评分比较 脊髓损伤前，3组大鼠BBB评分为21.00分。脊髓损伤后，损伤对照组及运动训练组BBB评分均低于假手术组（均P＜0.05）。损伤后1～2周，运动训练组BBB评分与损伤对照组差异无统计学意义；损伤3周后运动训练组BBB评分高于损伤对照组（P＜0.05），见表1。

Table 1 BBB scores of rats in each groups at different time points表1 各组大鼠不同时间点BBB评分 （n=8±s）

Table 1 BBB scores of rats in each groups at different time points表1 各组大鼠不同时间点BBB评分 （n=8±s）

＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，b与损伤对照组比较，P＜0.05

组别假手术组损伤对照组运动训练组F损伤前21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 -损伤后1周21.00±0.00 3.43±1.19a3.45±1.37a494.000＊＊损伤后2周21.00±0.00 9.13±1.36a11.51±1.64a131.045＊＊组别假手术组损伤对照组运动训练组F损伤后3周21.00±0.00 10.42±1.68a14.13±1.75ab70.459＊＊损伤后4周21.00±0.00 11.72±1.79a16.01±1.98ab48.862＊＊损伤后5周21.00±0.00 13.24±1.86a17.32±2.13ab30.480＊＊

2.2 BDNF免疫组化检测结果 BDNF免疫反应阳性产物多分布于脊髓前角的神经元内，脊髓后角及中央管周围也有出现。运动训练组BDNF阳性染色颗粒明显增多，见图1。运动训练组平均光密度值高于假手术组和损伤对照组（P＜0.05），见图2。

Figure 1 Expression of BDNF in spinal cord tissues of rats detected by immunohistochemistry(immunohistochemical staining,×200)图1 各组大鼠脊髓内BDNF蛋白的表达(免疫组化染色，×200)

Figure 2 Integrated optical density of BDNF protein expression in spinal cord tissues of rats in each groups图2 各组大鼠脊髓内BDNF蛋白平均光密度值

2.3 TrkB免疫组化检测结果 TrkB免疫反应阳性产物较多分布于脊髓前角、后角、中央管周围等处。运动训练组TrkB阳性染色颗粒增多，见图3。运动训练组平均光密度值高于假手术组和损伤对照组（P＜0.05），见图4。

Figure 3 Expression of TrkB protein in spinal cord tissues of rats detected by immunohistochemistry(immunohistochemical staining,×200)图3 各组大鼠脊髓内TrkB蛋白的表达(免疫组化染色，×200)

Figure 4 Integrated optical density of TrkB protein expression in spinal cord tissues of rats in each groups图4 各组大鼠脊髓内TrkB蛋白平均光密度值

2.4 Western blot检测结果 运动训练组大鼠脊髓内BDNF和TrkB蛋白表达较损伤对照组、假手术组增高，见图5。

Figure 5 Expression of BDNF and TrkB proteins in spinal cord tissues of rats detected by Western blot图5 Western blot检测SCI大鼠脊髓组织中BDNF和TrkB蛋白表达

3 讨论

研究表明，运动训练可以促进中枢神经系统的功能结构重组及可塑性改变[4-5]，并改善SCI患者肢体运动和感觉功能障碍的恢复[1]。但其神经生物学基础并不十分清楚。本研究于SCI大鼠损伤后1周开始进行4周运动训练，采用BBB评分观察运动训练后SCI大鼠后肢运动功能的变化。结果显示，损伤后第1～2周，运动训练组与损伤对照组BBB评分无明显差异，与其他学者研究结果一致[6]。而损伤后第3～5周，运动训练组BBB评分高于损伤对照组，提示运动训练可促进SCI大鼠后肢运动功能的恢复。

BDNF是神经营养因子家族的重要成员，对中枢神经系统神经元的生长、发育、维持和损伤修复具有重要影响[2,5]。研究发现，BDNF能够提高受损脊髓运动和感觉神经元的存活，促进神经元的再生与修复[7]。BDNF基因修饰的神经干细胞移植可促进大鼠脊髓损伤后轴突再生及后肢运动功能的恢复，优于未修饰的神经干细胞移植，提示BDNF可促进SCI神经轴突的结构重建从而促进后肢运动功能恢复[8]。目前研究认为，BDNF通过与其受体TrkB结合，激活MAPK、PI3K等信号通路活化CREB，发挥促进神经元存活以及增强突触可塑性的作用[9-10]。鉴于BDNF及其受体TrkB对神经元生理功能的维持及损伤后修复的积极作用，笔者研究了BDNF及其受体TrkB在运动训练促进脊髓损伤修复中的可能作用，结果显示4周运动训练后SCI大鼠脊髓内BDNF及TrkB表达均上升，提示BDNF及其受体TrkB可能参与了损伤脊髓的修复。结合BBB评分结果，运动训练组BBB评分高于与同一时间点上的损伤对照组，表明规律的运动训练后SCI大鼠后肢运动功能的改善，可能与脊髓内BDNF及TrkB表达上调有关。

综上所述，运动训练可诱导SCI大鼠脊髓内BDNF及其受体TrkB表达，促进SCI大鼠运动功能恢复，为康复训练治疗脊髓损伤后神经重建修复提供了新的实验依据。然而运动训练促进BDNF表达增加的分子机制尚不十分清楚，有待深入研究。

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（2013-11-01收稿 2014-02-21修回）

（本文编辑 陈丽洁）

Effects of Exercise on Expressions of Brain-Derived Neurotrophic Factor and Tyrosine Kinase Receptor B in Injured Spinal Cord of Rats

HE Xiaoyu
Guangdong Provincial Institute of Sports Science,Guangzhou 510663,China

ObjectiveTo investigate the effects of exercise on expressions of brain-derived neurotrophic factor (BDNF)and tyrosine kinase receptor B(TrkB)in spinal cord of spinal cord injury(SCI)rats.MethodsSpinal cord injury models were produced by universal spinal cord impact system.Twenty-four Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups,exercise group(SCI-induction and exercises,n=8),control group(SCI-induction without exercises,n=8)and shamoperation group(no operation,without SCI nor exercises,n=8).Exercise training began from the 7th day after injury for 4 weeks.The locomotor function was assessed by Basso-Beattic-Bresnahan(BBB)scale before injury and at the 1st,2nd,3rd, 4th and 5th week post injury.The expressions level of BDNF and TrkB in spinal cords were detected by immunohistochemistry and Western blot.ResultsSince the 3rd week after injury(after 2 weeks of exercise training),BBB scores in exercise group were higher than that in control group(P＜0.05).In immunohistochemistry test,positive immunologic reaction to BDNF protein was mainly located in anterior horn of spinal cord,and the expression level in exercise group was significantly higher than that in sham-operation group and control group(P＜0.05).In immunohistochemistry test,positive immunologic reaction to TrkB protein was located in anterior horn and dorsal horn and central canal of spinal cord,and the expression level in exercise group was significantly higher than that in sham-operation group and control group(P＜0.05).Expression of BDNF and TrkB in exercise group rats after exercise for 4 weeks were significantly increased,compared with that in control group.ConclusionExercise training may effectively induce BDNF and TrkB expression in spinal cords and promote the recovery of locomotor function of SCI rats.

spinal cord injuries;exercise therapy;brain-derived neurotrophic factor;receptor,trkB;immunohistochemistry;blotting,Western;exercise training

R651.21

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.010

*广东省科技计划项目科技基础条件建设项目（项目编号：2010B060500021）

广东省体育科学研究所（邮编510663）

△通讯作者 E-mail：gzhxy2010@126.com