刘 辉 李建宇 王凤梅 王 鹏 李成龙 骆 莹 朱争艳△

HBV感染的肝癌患者外周血中调节性T细胞的水平分析*

刘 辉1李建宇2王凤梅1王 鹏1李成龙1骆 莹1朱争艳1△

目的 检测乙肝病毒(HBV)感染的肝癌患者外周血中CD4+CD25+CD127low调节性T细胞(Tregs)的水平，分析其与HBV感染的相关性。方法采集41例感染HBV的肝癌患者（HBV+组）、34例未感染HBV的肝癌患者（HBV-组）及29例正常健康受试者（对照组）的外周抗凝血，利用流式细胞术检测各组受试者外周血中CD4+CD25+CD127lowTregs水平，通过荧光定量聚合酶链反应检测感染HBV的肝癌患者血清中HBV DNA载量，分析Tregs水平与HBV DNA载量的相关性。结果HBV+组外周血中CD4+CD25+CD127lowTregs占CD4+T细胞的比率显著高于HBV-组和对照组[(8.24±2.20)%vs(7.06±2.46)%vs(6.51±1.99)%,P＜0.05]，HBV-组高于对照组；CD4+CD25+CD127lowTregs水平与HBV DNA载量(取对数转换)呈正相关(r=0.350，P＜0.05)。结论肝癌患者外周血中Tregs的水平异常增高，且与HBV DNA复制密切相关，这可能是肝癌细胞免疫逃逸的重要原因。

肝肿瘤；肝炎，乙型；T淋巴细胞,调节性；免疫功能；CD127

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，乙肝病毒(HBV)感染是肝癌发病的主要原因，许多肝癌患者体内都可检测到HBV DNA的复制[1]。研究发现，HBV DNA具有4个开放的阅读框，其中X基因编码蛋白可诱导肝细胞的癌变及恶性进展[2]。目前，针对肝癌的传统治疗效果均不甚理想，免疫治疗正逐渐成为肝癌临床治疗的一种辅助或替代疗法。调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)是具有免疫调节功能的细胞亚群，在免疫应答的负调节及自身免疫耐受中发挥重要作用[3]。研究发现，多种肿瘤患者体内Tregs水平异常升高，提示Tregs对免疫应答的抑制作用可能促进了肿瘤的发生发展[4]。本课题前期研究发现，Tregs水平的变化可以准确反映肝癌的恶性程度与进展水平[5]，但关于Tregs水平与HBV DNA复制的相关性还未完全阐明。本研究通过检测HBV感染的肝癌患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTregs的水平，分析其水平差异与HBV DNA载量变化的相关性，探讨肝癌发生发展中的免疫逃逸机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年6月—2013年6月入住我院肝内科的75例原发性肝癌患者，诊断参照第四届全国肝癌学术会议制定的《原发性肝癌临床诊断标准》，其中41例感染HBV(HBV+组)，34例未感染HBV(HBV-组)，所有患者均排除药物、乙醇及其他肝炎病毒感染等原因造成的肝脏损害，且在半年内未经免疫抑制剂及抗病毒治疗。另选取正常健康受试者29例为对照组，经查体，血尿常规、心电图、胸片、腹部B超及肝肾功能、肝病自身抗体均无异常。

1.2 试剂及仪器 鼠抗人单克隆抗体：anti-CD4-FITC抗体、anti-CD25-PECY5抗体、anti-CD127-PE抗体及各自的同型对照(美国Beckman公司)；HBV DNA定量检测试剂盒(北京达安基因有限公司)；Epics Altra流式细胞仪(美国Beckman公司)，KDC-1042离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，ViiATM7荧光定量PCR仪(美国Life公司)，CHA-S恒温振荡器(江苏金城国胜实验仪器厂)。

1.3 CD4+CD25+CD127lowTregs水平的检测 采集受试者外周静脉血，加入EDTA进行抗凝处理，利用CD4、CD25、CD127三抗原标记法检测Tregs水平。具体操作如下：每个样品分设检测管和对照管。检测管内依次加入CD4-FITC抗体、CD25-PECY5抗体及CD127-PE抗体各10 μL，对照管内依次加入CD4-FITC抗体、CD25同型对照-PECY5抗体及CD127同型对照-PE抗体各10 μL，而后分别向检测管和对照管内加入受试者的抗凝外周血100 μL，混匀，避光孵育30 min，加入4.5 mL溶血素溶血，37℃避光振荡10 min，1 600 r/min离心5 min，弃上清，加入1%多聚甲醛固定后，上流式细胞仪进行检测。利用Expo32软件进行数据处理，分析CD4+CD25+CD127lowTregs细胞占CD4+T细胞的百分率。

1.4 HBV DNA载量的测定 采用荧光定量PCR法检测感染HBV的肝癌患者血清中HBV DNA载量，具体操作按照试剂盒说明书进行。根据标准曲线得出目的基因DNA的分子拷贝数，并将DNA拷贝数经对数转换后用于统计学分析。

1.5 统计学方法 数据采用SPSS 13.0进行统计处理，结果以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间多重比较采用LSD-t检验，相关分析采用Pearson法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组外周血中CD4+CD25+CD127lowTregs的检测水平比较 HBV+组的CD4+CD25+CD127lowTregs水平高于HBV-组和对照组，HBV-组高于对照组(P＜0.05)，见图1、表1。

Figure 1 CD4+CD25+CD127lowTregs level in different groups图1 各组受试者CD4+CD25+CD127lowTregs水平比较

Table 1 The CD4+CD25+CD127lowTregs level in different groups表1 各组外周血CD4+CD25+CD127lowTregs水平比较（±s）

Table 1 The CD4+CD25+CD127lowTregs level in different groups表1 各组外周血CD4+CD25+CD127lowTregs水平比较（±s）

＊P＜0.05；a与对照组比较，b与HBV-组比较，P＜0.05

组别对照组HBV-组HBV+组F n 29 34 41 CD4+CD25+CD127low/CD4+(%) 6.51±1.99 7.06±2.46a8.24±2.20ab7.397＊

2.2 HBV+肝癌患者CD4+CD25+CD127lowTregs水平与HBV DNA载量的相关性 HBV+肝癌患者的CD4+CD25+CD127lowTregs水平与HBV DNA载量(经对数转换为4.59±1.36)呈正相关(r=0.350，P＜0.05)。

3 讨论

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，其恶性度高，易发生侵袭和转移[6]，我国肝癌发病人数占全球肝癌患者的55%[7]。目前，针对肝癌的传统治疗效果均不甚理想，其中手术切除率较低，而全身化疗和放疗方法，因肿瘤反应率低、不良反应大，已淡出肝癌的主流治疗[8]。因此，探索有效的免疫治疗途径，对降低肝癌患者的病死率将具有重要意义。

Tregs是一类在肿瘤免疫应答的负调节中发挥重要作用的细胞亚群。研究发现，多种肿瘤患者体内Tregs水平异常增高，降低Tregs水平或阻断其活性可提高肿瘤免疫治疗的有效性[4]。目前关于Tregs在肝癌发生发展中的作用还不明确，研究结果不一致[9]，这主要是由于流式检测中抗体的标记手段不同所致[10]。传统的方法主要是通过CD25标记Tregs水平，但CD25阳性的Tregs在很大程度上与CD4阳性的T细胞相重叠，影响了Tregs的准确检出。因此，寻找Tregs的特异性标记物是近年来的研究热点。CD127(白细胞介素-7受体，IL-7R)是最新发现的一种与Tregs密切相关的表面抗原，可作为识别Tregs的理想标记物[11]。研究发现，利用CD4+CD25+CD127low标记的T细胞具备了Tregs的典型特征，通过该方法可深入探讨Tregs的免疫功能及各类肿瘤的发病机制[12]。本研究前期通过流式细胞术对肝癌患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTregs水平进行了检测，发现Tregs水平的变化可以准确反映肝癌的恶性程度与进展水平[5]，但关于不同肝癌患者体内Tregs水平变化的调控机制还不清楚。

HBV感染被认为是肝癌发病的主要原因，不同肝癌患者体内Tregs水平的差异可能与HBV感染及其DNA复制有关。本实验发现不同肝癌患者体内的Tregs水平均显著高于健康受试者体内的Tregs水平，与前期研究结果一致，进一步证实了Tregs在肝癌发生发展中的促进作用。另外，感染HBV的肝癌患者体内Tregs水平显著高于未感染HBV的肝癌患者体内Tregs水平，提示HBV可能参与了肝癌患者体内Tregs水平的调控。本研究还发现肝癌患者体内的Tregs水平随HBV DNA载量的增高而逐渐升高，两者呈正相关，提示肝癌患者体内HBV的复制可能促进了Tregs水平的上调。

综上，肝癌患者体内CD4+CD25+CD127lowTregs的水平异常增高，且HBV DNA的复制可能促进了Tregs的免疫抑制效应，这可能是肝癌细胞免疫逃逸的重要原因。

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（2013-12-17收稿 2012-02-01修回）

（本文编辑 闫娟）

Analysis of CD4+CD25+CD127lowRegulatory T Cells in Peripheral Blood of Hepatocellular Carcinoma Patients with HBV Infection

LIU Hui1,LI Jianyu2,WANG Fengmei1,WANG Peng1,LI Chenglong1,LUO Ying1,ZHU Zhengyan1
1 Institute of Hepatobiliary Disease,Tianjin Third Central Hospital,Tianjin Key Laboratory of Artificial Cell,Tianjin 300170, China；2 Department of Chemical Pharmacy,Logistics College of Chinese People’s Armed Police Forces

ObjectiveTo investigate the level of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells(Tregs)in the peripheral blood of hepatocellular carcinoma(HCC)patients with HBV infection and to explore the relationship between these cells and HBV infection.MethodsPeripheral blood mononuclear cells were isolated from 41 HCC patients infected with HBV,34 HCC patients without HBV infection and 29 healthy persons.These mononuclear cells were labeled with the monoclonal antibodies of CD4,CD25 and CD127,and then Tregs level was determined by flow cytometry(FCM).Moreover,the load of HBV DNA in the blood serum of HCC patients with HBV infection was detected by fluorescent quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR).ResultsThe percentage of CD4+CD25+CD127lowTregs in CD4+T cells in the HCC patients with HBV infection was higher than that in the HCC patients without HBV infection[(8.24±2.20)%vs(7.06±2.46)%,P＜0.05]and that in the healthy persons[(8.24±2.20)%vs(6.51±1.99)%,P＜0.01].Furthermore,the percentage of CD4+CD25+CD127lowTregs in CD4+T cells in the HCC patients without HBV infection was higher than that in the healthy persons[(7.06±2.46)%vs(6.51± 1.99)%,P＜0.05].In addition,the level of CD4+CD25+CD127lowTregs in the HCC patients with HBV infection was gradually increased following the increase of HBV DNA load and there was a positive correlation between the level of CD4+CD25+CD127lowTregs and the load of HBV DNA(r=0.350，P＜0.05).ConclusionThe level of CD4+CD25+CD127lowTregs in HCC patients is increased remarkably and associated with the number of HBV DNA copy,which may be an important mechanism of immunologic escape of virus in HCC.

liver neoplasms;hepatitis B;T-lymphocytes,regulatory;immunologic function;CD127

R392.1，R735.7

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.005

*天津市科委面上项目(编号：13JCYBJC22500)；天津市卫生局科技基金(项目编号：2010KY03)；天津市高新技术产业化专项资金(项目编号：津发改高技[2006]26号)

1天津市第三中心医院肝胆疾病研究所，天津市人工细胞重点实验室（邮编300170）；2武警后勤学院药物化学教研室

△通讯作者 E-mail：Zhuzhengyan59@163.com