国产替米沙坦分散片与进口替米沙坦片在健康志愿者中的生物等效性研究

2014-05-18肖亚宝杨海淼宋冬梅

中国医药指南 2014年21期

关键词：分散片沙坦米沙坦

肖亚宝杨海淼宋冬梅

（1 浙江泰利森药业有限公司，浙江嘉兴314300；2 长春中医药大学附属医院，吉林长春130103；3 沈阳亿灵医药科技有限公司，辽宁沈阳110179）

国产替米沙坦分散片与进口替米沙坦片在健康志愿者中的生物等效性研究

肖亚宝1杨海淼2宋冬梅3

（1 浙江泰利森药业有限公司，浙江嘉兴314300；2 长春中医药大学附属医院，吉林长春130103；3 沈阳亿灵医药科技有限公司，辽宁沈阳110179）

目的在24名男性健康受试者中比较国产替米沙坦分散片与原研进口替米沙坦片的生物等效性。方法筛选24名健康男性志愿者，采用随机交叉试验设计，应用高效液相色谱-荧光检测法测定血浆中替米沙坦的浓度，根据测定结果计算主要药动学参数，并以进口替米沙坦片为参比制剂，评估替米沙坦分散片的生物等效性。结果经DAS2.1.1数据统计软件计算药动学参数，受试制剂A的t1/2：（27.94±9.94）h、Cmax：（757.9±238.3）ng/mL、Tmax：（1.18±0.49）h、AUC0-t：（4423±2645）ng/（h·mL）、AUC0-∞：（4804±3146）ng/（h·mL）；受试制剂B的t1/2：（25.58±8.56）h、Cmax：（763.4±283.3）ng/mL、Tmax：（1.22±0.52）h、AUC0-t：（4195 ±1988）ng/（h·mL）、AUC0-∞：（4437±2122）ng/（h·mL）；参比制剂的t1/2：（28.98±11.66）h、Cmax：（755.6±268.2）ng/mL、Tmax：（1.15±0.51）h、AUC0-t：（4327±2039）ng/（h·mL）、AUC0-∞：（4622±2201）ng/（h·mL）。以AUC0-t计算，与参比制剂相比受试制剂A、受试制剂B中替米沙坦的相对生物利用度分别为（99.2±26.8）%、（98.3±26.4）%。结论国产替米沙坦分散片与原研进口替米沙坦片具有生物等效性。

替米沙坦；生物等效性；高效液相色谱法

替米沙坦为德国Boehringer Ingelheim制药公司研制开发的特异性的非肽类血管紧张素Ⅱ受体（AT1亚型）拮抗剂。临床上主要用于治疗原发性高血压。本品与AT1亚型有高亲和力，通过选择性抑制血管紧张素Ⅱ与AT1受体结合，并降低血醛固酮水平，从而产生降压作用。目前已在国内外上市使用。本试验采用乙醚-二氯甲烷为提取溶剂，通过酸化处理方法进行血浆样品的提取，建立高效液相色谱-荧光检测法测定血浆中替米沙坦药物浓度，并以进口替米沙坦片（商品名：美卡素）作参比制剂，比较国产替米沙坦分散片与进口替米沙坦片的生物等效性。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

受试制剂A：替米沙坦分散片，40毫克/片，批号：081101；受试制剂B：替米沙坦分散片，80毫克/片，批号：081102；受试制剂A、B均由浙江泰利森药业有限公司生产；参比制剂：替米沙坦片，80毫克/片，批号：804188，Boehringer Ingelheim International GmbH生产、上海勃林格殷格翰药业有限公司分装；替米沙坦对照品（批号：080901；浙江省食品药品检验所标定），内标（坎地沙坦，批号：20090601；威海迪素制药有限公司），甲醇、乙腈均为色谱纯（山东禹王实业有限公司化工分公司），水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

LC-10ATvp型高效液相色谱仪，Agilent荧光检测器，Agilent ChemStation for LC工作站。FA1004电子天平（上海恒平科学仪器有限公司），XW-80A微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司），TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂），MTN-2800W氮吹浓缩装置（天津奥特塞恩斯仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 受试者

获医学伦理委员会审批同意，24名健康男性志愿受试者，年龄18～40岁，体质量指数（BMI）在19～24，无心、肝、肺、肾、消化道、神经系统、精神异常及代谢异常等疾病，经体格检查血压、心电图、呼吸状况及肝、肾功能、血象均无异常，试验前2周内未服过任何药物，自愿参加试验并于试验前签署知情同意书。

1.3.2 标本采集

图1 空白血浆

图2 替米沙坦＋内标

受试者于试验前1 d吃清淡晚餐后过夜（禁食10 h后），于次日早7时在室温条件下空腹将2片(40毫克/片)受试制剂A或1片（80毫克/片）受试制剂B或1片（80毫克/片）参比制剂（药物总剂量80毫克）用250 mL温开水送服。14 d后交叉服药。分别于给药前及给药后0.167、0.333、0.667、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48、72、96 h由静脉采血5 mL。3500 rpm离心10 min，分离血浆，分离出的血浆样本于-70 ℃保存至分析（注意以上过程需避光操作）。

1.4 血药浓度测定

1.4.1 色谱条件

色谱柱（Diamonsil C18柱，200 mm×4.6 mm，5 μm），预柱（琛航C18保护柱），流动相为0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（pH 3.13± 0.02）-乙腈（57∶43），荧光激发波长（Excitation）300 nm，荧光发射波长（Emission），385 nm；流速：1.2 mL/min；进样量：50 μL；柱温：30 ℃。

1.4.2 样品处理

将解冻后血浆样品涡旋30 s，精密量取血浆500 μL，置于5 mL离心管中，依次加入甲醇-水（1∶1）50 μL，坎地沙坦内标溶液50 μL，10%的磷酸溶液100 μL，再加入乙醚-二氯甲烷（3∶2）3 mL，涡旋混匀30 s，振荡10 min，离心5 min（15000 rpm），移取有机相于另一5 mL离心管中，40 ℃水浴空气流下吹干。残留物用200 μL流动相复溶，涡旋混匀30 s，转移溶液于另一1.5 mL离心管中，离心5 min（15000 rpm），取上清液50 μL进样分析（以上均避光操作）。

1.5 方法学考察

1.5.1 标准曲线的制备

于空白血浆中加入不同量的替米沙坦标准溶液，配制成血浆中替米沙坦浓度为2.1、4.1、10.2、51.2、204.8、819.2、1228.8 ng/mL的样品，按“血浆样品处理方法”项下自加入“坎地沙坦内标溶液50 μL”起同法试验，每一浓度进行双样本分析，制备替米沙坦的标准曲线。以待测物浓度为横坐标X，待测物与内标物的峰面积比值（AS/Ai）为纵坐标Y，用加权最小二乘法[2]（权重系数：1/χ2）进行线性回归运算，求得的线性回归方程即为标准曲线方程。

1.5.2 准确度与精密度试验

在空白血浆中分别加入不同量的替米沙坦标准溶液，配制成血浆中替米沙坦浓度为5.1、81.9和1024.0 ng/mL的血浆样品（每浓度六样本分析），按“血浆样品处理方法”项下自加入“坎地沙坦内标溶液50 μL”起同法试验，连续测定三批（与标准曲线的测定同时进行），计算血浆样品的浓度，求得方法的精密度与准确度。

1.5.3 稳定性考察

配制低、高（5.1、1024.0 ng/mL）2个浓度的血浆样品（每浓度三样本分析），考察血浆样品冷冻-解冻3个周期后的稳定性、长期冷冻条件下血浆样品的稳定性。

1.6 回收率

配制低、中、高（5.1、81.9和1024.0 ng/mL）3个浓度的替米沙坦血浆样品（每浓度六样本分析），按“血浆样品处理方法”项下自加入“坎地沙坦内标溶液50 μL”起同法试验，获得相应色谱峰面积；另取对应浓度的替米沙坦标准溶液50 μL，加入坎地沙坦内标溶液50 μL，流动相100 μL（每浓度六样本分析），涡旋混合30 s，取50 μL进样分析，获得相应色谱峰面积（6次测定的平均值）。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。

图3 受试制剂A血浆样品色谱图

图4 受试制剂B血浆样品色谱图

1.7 质量控制

为减少系统误差，每批样品分析时，建立随行标准曲线计算血药浓度，随行标准曲线用加权最小二乘法[2]（W=1/χ2）进行线性回归运算，同时平行测定低、中、高三个浓度（替米沙坦第一分析批：5.1、81.9、1024.0 ng/mL；第二～四分析批：5.1、80.7、1009.0 ng/mL；第五～七分析批：5.0、79.2、990.0 ng/mL）的质控样品，质控样品测定结果的RE应在±15%之内，最多允许33%不在同一浓度的质控样品结果超限，当批数据方可接受。

1.8 数据处理

采用DAS 2.1.1数据统计软件将相关药动学参数（Cmax、AUC0-t、AUC0-∞）进行对数转换以评价受试者分别服用参比制剂和受试制剂后的药动学参数及相对生物利用度。Tmax宜采用非参数检验法的秩和检验判定两制剂是否具有显著性差异。生物等效性评价是通过计算受试制剂和参比制剂Cmax、AUC0-t和AUC0-∞的对数比值的（取对数后）90%置信区间进行的。AUC的对数比值的90%置信区间在80%～125%，Cmax对数比值的90%置信区间在75%～ 133%，则可判定受试制剂A和受试制剂B分别与参比制剂具有生物等效性。

2 结果

2.1 方法特异性及色谱行为

图1～图4分别为空白血浆、空白血浆加替米沙坦标准溶液和内标溶液、受试制剂A血浆样品、受试制剂B血浆样品色谱图。

上述色谱图结果表明，坎地沙坦保留时间为6.8 min左右，替米沙坦的保留时间为10.7 min左右，血浆中内源性物质不干扰替米沙坦和内标物坎地沙坦的测定。

2.2 标准曲线和最低定量限

以血浆中替米沙坦浓度对替米沙坦与坎地沙坦的峰面积比值（AS/ Ai）进行线性回归。结果表明，替米沙坦在2.1～1228.8 ng/mL范围内与待测物和内标物峰面积之比线性关系良好，回归方程及相关系数分别为：Y=0.00202+0.02496×X，R=0.9999（n=7），本试验建立的高效液相色谱法测定血浆中替米沙坦浓度的定量下限为2.1 ng/mL。

2.3 方法精密度与准确度

本试验所建立的高效液相色谱法测定的准确度和批内、批间精密度均达到试验要求[1]。见表1。

2.4 回收率

低、中、高浓度（5.1、81.9、1024.0 ng/mL）的血浆样品提取回收率分别为75.0%、74.1%和77.3%，RSD（%）分别为4.9%、0.7%和3.2%（n=6）。

2.5 稳定性及质量控制

结果表明，替米沙坦血浆样品经过3次冷冻—解冻循环后稳定，在-20 ℃保存94 d内稳定。见表2。

为减少系统误差，每批血浆样品分析时，建立随行标准曲线计算血药浓度，随行标准曲线用加权最小二乘法[2]（W=1/χ2）进行线性回归运算，同时平行测定低、中、高3个浓度的质控样品，质控样品测定结果的RE均在±15%之内，符合有关规定[1]。

2.6 药动学参数及结果

24名健康受试者分别口服替米沙坦分散片受试制剂A、受试制剂B和替米沙坦片参比制剂后药-时曲线见图5。主要药动学参数以及生物利用度结果见表3。

表1 替米沙坦精密度与准确度

表2 替米沙坦血浆样品3次冷冻解冻循环稳定性

表3 受试制剂A、B和参比制剂主要药动学参数

2.7 生物等效性结果

方差分析结果显示，AUC0-t、AUC0-∞和Cmax在药剂间、周期间的差异均无统计学意义（P＞0.05），但是在个体间的差异有统计学意义（P＜0.05）。采用双单侧t检验和[1-2α]置信区间法进行生物等效性评价，其中Tmax采用非参数检验法。结果表明，替米沙坦分散片受试制剂A、受试制剂B的AUC0-t、AUC0-∞和Cmax均拒绝生物不等效假设。受试制剂A中，替米沙坦AUC0-t的90%置信区间为参比制剂的87.8%～105.1%，AUC0-∞的90%置信区间为参比制剂的87.7%～105.3%，Cmax的90%置信区间为参比制剂的92.5%～110.0%。受试制剂B中，替米沙坦AUC0-t的90%置信区间为参比制剂86.9%～104.1%，AUC0-∞的90%置信区间为参比制剂的85.6%～102.8%，Cmax的90%置信区间为参比制剂的91.1%～108.3%。Tmax在受试制剂A、受试制剂B与参比制剂间的Tmax均无显著性差异。

根据以上结果判定，浙江泰利森药业有限公司提供的国产替米沙坦分散片（受试制剂A，规格：40毫克/片和受试制剂B，规格：80毫克/片）与Boehringer Ingelheim International GmbH生产、上海勃林格殷格翰药业有限公司分装的原研药品替米沙坦片（参比制剂，商品名：美卡素®，规格：80毫克/片）具有生物等效性。