颜平等

摘 要 利用SRAP标记技术分析了来自海南岛22个居群地的144份海南钻喙兰野生资源的遗传多样性。结果显示，从100对SRAP引物组合中筛选出24对引物组合，共检测出390个位点，平均每对引物组合检测位点为16.2个，其中多态性位点为299个，占76.9%；利用NTSYS-pc2.10软件，计算海南钻喙兰材料间的相似系数并采用最大距离法（COMPLETE）进行聚类分析，结果144份材料间的相似系数范围为0.508～0.959，平均为0.691，在相似系数为0.515处可将144份材料分为Ⅰ、Ⅱ 2大组，在相似系数为0.600处，Ⅰ组可分为3个亚组，Ⅱ组可分为9个亚组，东方市板桥镇的材料相似系数最大，乐东县佳西热带雨林保护区与采自琼中县红毛镇的材料间相似系数最小。聚类结果出现“大杂居、小聚居”的现象，表明海南钻喙兰遗传距离与地理距离不完全相关。

关键词 海南钻喙兰；种质资源；SRAP标记；遗传多样性

中图分类号 S682.31 文献标识码 A

Abstract We conducted the genetic diversity analysis of 144 Rhynchostylis gigantea（Lindley）Ridley wild resources form 22 population inhabitations in Hainan Province， by means of SRAP labeling technique. It showed that 390 loci were tested out by 24 primer combinations， which had been screened out from 100 SRAP primer pairs beforehand. Each primer combination could test out about 16.2 loci. Thereinto， polymorphic sites were 299， accounting for 76.9%. Afterwards， we calculated the similarity factors of these R. gigantean materials by NTSYS-2.10， then used maximum distance method（COMPLETE）to do clustering analysis. The results showed that the similarity factors of the 144 materials ranged from 0.508 to 0.959， while the average level is 0.691. At the same time， the 144 materials could be divided into two groups：GroupⅠand GroupⅡwhen the similarity factor was 0.515. GroupⅠcould be divided into 3 subgroups while GroupⅡcould be divided into 9 subgroups when the similarity factor was 0.600. The materials from Banqiao Town， Dongfang City had the maximum similarity factor while the ones from Jiaxi rain forest conservation area， Ledong County and Hongmao Town， Qiongzhong County had the minimum similarity factors. The clustering results showed that most materials in one population inhabitation clustered together while few materials clustered to the ones from other population habitations， meaningthe genetic of R. gigantean and geographic distance was partially correlative.

Key words Rhynchostylis gigantea（Lindl.）Ridl.； Germplasm resources； SRAP labeling technique； Genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.003

海南钻喙兰[Rhynchostylis gigantea（Lindley）Ridley]又名安诺兰、无耳兰，是兰科（Orchidaceae）钻喙兰属（Rhynchostylis Blume）多年生草本植物，为典型的热带附生兰。海南钻喙兰多生于海拔1 000 m以下疏林中的树干上，主要分布于缅甸、越南、泰国、马来西亚等东南亚国家及中国海南[1-2]。海南钻喙兰株型紧凑，花繁色艳，芳香怡人，具有很高的观赏价值和开发应用前景。海南钻喙兰盛花期为春节前后，是极好的新春贺岁花卉。在育种应用方面，海南钻喙兰具有花朵数多、香味浓、耐热性强和易杂交等优良性状，其作为第一代杂交亲本，目前在英国皇家园艺协会登录的新杂交属就有34个。目前国内对海南钻喙兰的研究多集中在组培快繁、观赏形状评价、核型分析等方面[3-7]，但在种质收集及遗传多样性分析方面未见报道。因此，从兰花资源保护、育种产业的发展及开发利用角度，对海南钻喙兰资源进行全面的收集、了解其遗传多样性显得十分重要。

相关序列扩增多态性（Sequence-related amplified-polymorphism，SRAP）是一种新型的基于PCR扩增的标记系统，该标记技术是由美国加州大学蔬菜作物系Li等[8]于2000年发明的，标记采用长17～18 bp的引物对开放阅读框（ORFs）进行扩增，因不同物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。该标记具有操作技术简便快速、多态性高、结果稳定、再现性高、不需预知物种的序列信息等优点，应用范围广。目前该技术在红掌[9]、海南野生兰[10]、大花蕙兰[11]、龙血树[12]等研究上均有报道，在植物遗传多样性分析[13]、种质及品种鉴定[14]、遗传连锁图的构建[15]、基因组学[16]研究等方面亦得到广泛应用。笔者利用SRAP标记技术对144份海南钻喙兰材料进行遗传多样性及聚类分析，旨在为海南钻喙兰核心种质库的构建及种质创新奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2012年8月至2013年6月在海南全岛范围内调查野生海南钻喙兰种质资源期间，在海南9个市（县）共发现22个野生海南钻喙兰居群。144份供试海南钻喙兰叶片DNA样本，来自于这22个野生海南钻喙兰居群（表1）。

PCR反应试剂全部购自Thermo公司；引物采用Li和Quiros[8]设计的10条上、下游引物，由上海英俊公司合成，引物序列号见表2。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及检测 采用改良CTAB法[17]提取DNA，提取的DNA用Thermo scientific公司的Nandodrop 2000分光光度计测定OD260、OD280，并根据该值检测DNA质量、计算DNA浓度；同时经10 g/L的琼脂糖胶电泳（110 V稳压，15 min）进一步检验。

1.2.2 SRAP-PCR 扩增体系及程序 采用本实验室优化的SRAP-PCR反应体系（20 μL）扩增，具体为：模板DNA 60 ng，Mg2+浓度为2.0 mmol/L，引物浓度为1.0 umol/L，Taq DNA聚合酶浓度为1.5 U/20 μL，dNTPs浓度为0.20 mmol/L，10×Buffer为2 μL，用ddH2O补足到20 μL。PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min、35 ℃复性1 min、72 ℃延伸1 min，5个循环；94 ℃变性1 min、50 ℃复性1 min、72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.3 引物筛选 采用不同居群的4份海南钻喙兰模板DNA，对正、反向各10条引物100个组合进行筛选，选出扩增条带多、多态性好且清晰的引物组合。

1.2.4 PCR产物检测 采用北京六一仪器厂生产的DYY-10C型电泳仪，用60 g/L聚丙烯酰胺变性胶电泳分离PCR产物。电泳缓冲液为0.5×TBE，1 600 V、70 W电泳4 h，2 g/L AgNO3银染10～15 min，NaOH显影，晾干，统计条带。

1.3 数据统计与分析

扩增产物中只统计清晰、再现性强的条带，多态性条带按有带记为1、无带记为0 进行统计，生成“0”和“1”组成的原始矩阵。数据采用NTSYS-pc2.10软件中similarity程序计算相似系数，以clustering程序中SHAN进行COMPLETE聚类分析，绘制聚类分析树状图。

2 结果与分析

2.1 引物筛选及多态性分析

通过对100对引物组合的筛选，共筛选出24对扩增效果好、条带清晰、多态性高的引物组合，结果见表3。利用这24对引物组合对144份海南钻喙兰全基因组DNA进行扩增，各样本均可以扩增出清晰、重复性好、多态性高的条带（图1），扩增产物一般在1 500 bp以内。24对引物组合共检测位点390个，其中多态性位点为299个，占总扩增位点的76.9%，表现较丰富的遗传多样性。每对引物组合扩增的总条带数在10～24之间，平均16.2条；多态性条带数在6～19之间，平均12.5条，引物组合Me/8Em7扩增的总条带及多态性条带数最多。

2.2 遗传多样性及聚类结果

144份供试材料的遗传相似系数变化范围为0.508～0.959，平均值为0.691。其中来自东方市板桥镇中沙村的31号和32号材料之间的相似系数最大，达到0.959；琼中县红毛镇什寒村的97号材料和乐东县佳西热带雨林保护区的45号材料相似系数最小，为0.508；其他材料间的相似系数大多数在0.600～0.850之间。

基于SRAP的扩增结果，用COMPLETE法进行聚类分析，得到144供试材料的亲缘关系树状图（图2）。在相似系数为0.515的水平上，可将144份供试材料分为Ⅰ、Ⅱ 2大组：Ⅰ组包含佳西热带雨林保护区、阜龙乡可任、大里乡小妹、红毛镇什寒等居群地的海南钻喙兰，其遗传背景比较近；Ⅱ组包含其余居群地的海南钻喙兰。在相似系数为0.600的水平上，可将Ⅰ组分为Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅰ3三个亚组，Ⅱ组分为Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅱ5、Ⅱ6、Ⅱ7、Ⅱ8、Ⅱ9九个亚组。分组结果显示，同一采集地点的材料部分聚类在同一亚组，但也存在交叉和相对聚类现象，这与一个居群地存在多种表现型有关。保亭县、陵水县的居群内海南钻喙兰单株之间叶的大小及叶形存在较大差异，白沙县、琼中县的居群内海南钻喙兰单株之间花色及大小存在差异，五指山市的材料间花及叶的形态均存在较大差异。

3 讨论

目前，国内学者已经利用SRAP标记技术对兰科植物的遗传多样性进行了大量的研究，在文心兰[18]、国兰[19]、大花蕙兰[11]、石斛兰[20]等兰科植物上均表现出较高的多态性。本试验利用SRAP标记技术对22个采样点的144份海南钻喙兰材料进行种内遗传多样性分析，多态性比率为76.9%，相似系数变化范围为0.508～0.959，结果表明：海南岛上的野生海南钻喙兰资源表现出较高的遗传多样性和种内变异，该标记技术在海南钻喙兰上表现的高多态性与在其他兰科植物上相似。

本试验聚类结果显示，各材料并未严格地按地理界限聚在一起，同一地点采集的材料多数能聚类在同一组，少数则与其他采集地的材料聚在一起。这种交叉聚类现象说明，海南钻喙兰种质间的遗传距离与地理距离不完全相关，该结果与部分物种的研究结果类似。洪莉等[21]在对无患子种质资源多样性与亲缘关系的研究结果表明，各无患子种质并未严格按地理界限聚类，而是出现“大杂居、小聚居”的现象，并认为不同的适应气候环境能力导致各分布区的无患子个体遗传差异较大。汤正辉等[22]在对河南连翘居群遗传多样性研究时亦出现交叉聚类现象，得出连翘居群间遗传距离与地理距离没有相关性，并认为连翘本身生物学特性与生境差异是导致河南连翘遗传格局的主要原因。对于此类现象，学者们还有其他看法。杨雪等[23]在对巴山松的遗传多样性研究中认为居群取样个体数、基因位点数、系统树构建方法都会研究结果产生影响；李珊等[24]则认为遗传距离与地理尺度有关，大尺度上遗传距离与地理距离相关，而小范围内二者无相关性。

对于本试验的聚类结果与地理位置不完全相关的现象，笔者结合实地调查与结果分析，认为有两点原因导致该现象的产生。其一是海南钻喙兰自身生物学特性及环境的影响，海南钻喙兰多附生于高大的乔木上，其果荚在每年1～4月开裂，适逢海南岛干旱季节以及主要附主木棉（Bombax ceiba Linnaeus）的落叶期，在季风气候影响下海南钻喙兰种子易随风散播，使得各海南钻喙兰居群地存在多种类型。其二是取样的地理尺度小。本试验的144份供试材料虽取自海南岛的22个不同地点，但海南岛的面积小，东北至西南最长距离仅300 km，西北至东南最长距离为180 km，而22个样本采集点多分布在海南岛的西南及中部地区，它们之间的距离近则几公里，最远不过百余公里，使得本试验的取样地理尺度相对较小。对于产生该现象的原因推测，还得从后续的其他分子标记技术以及结合形态标记，对聚类结果进行验证。

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