朱家红等

摘 要 根据先前获得的EST序列，从橡胶树中克隆了1个编码泛素结合酶的基因HbUBC5。HbUBC5 cDNA长度为567 bp，编码185个氨基酸；HbUBC5在基因组中序列长度为2 441 bp，包含6个外显子和5个内含子。HbUBC5编码蛋白具有典型的植物泛素结合酶E2的结构特征，包含1个保守的UBC结构域和1个高度保守的半胱氨酸活性位点，和其他植物中的E2蛋白具有很高的同源性。对HbUBC5启动子区域进行分析，发现含有众多应答激素和胁迫信号元件。实时荧光定量分析结果表明，HbUBC5在树皮的表达量最高，在花中的表达量次之，在胶乳和叶片中的表达量相对较低；乙烯诱导能显著上调基因的表达。研究结果表明，HbUBC5能对乙烯做出响应，推测其可能参与了乙烯利刺激橡胶树产生副作用的过程。

关键词 巴西橡胶树；泛素结合酶；基因表达；乙烯利

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Abstract Based on EST sequence previously obtained， a gene named HbUBC5 from rubber tree coding ubiquitin conjugating enzyme was cloned. Sequence analysis revealed that HbUBC5 cDNA leght was 567 bp， encoding 185 amino acids and DNA length was 2 441 bp， containing six exons and five introns. HbUBC5 protein shared high identities to ubiquitin conjugating enzymes from other plants， had the typical structure of plant ubiquitin conjugating enzyme， containing a conserved UBC domain and a highly conserved cysteine active site. several regulatory elements related to hormone and stress responses were found in the putative promoter region of HbUBC5. The real-time RT-PCR results indicated the highest expression of HbUBC5 was found in bark， followed by flower， latex and leaf； HbUBC5 was also induced significantly by ethephon. The above results suggest that HbUBC5 can respond to ethylene and may be involved in the process of adverse effects caused by ethephon stimulation on rubber trees

Key words Hevea brasiliensis； Ubiquitin conjugating enzyme； Gene expression； Ethephon

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.009

泛素蛋白酶体途径（ubiquitin proteasome pathway，UPP）广泛存在真核生物中，能够通过选择性降解细胞核和细胞质中受损、异常和短命蛋白，在维持正常细胞功能及细胞周期运转、抵御环境胁迫、激素响应和衰老等方面发挥着重要的作用[1-5]。泛素分子主要通过泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素结合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，UBC/E2）和泛素蛋白连接酶（ubiquitin protein ligase，E3）的次第作用连接到目标蛋白上，目标蛋白泛素化后被26S蛋白酶体所识别和降解[1，3]。泛素结合酶是泛素蛋白酶体途径的重要组成部分，负责连接活化的泛素分子并将其移到泛素蛋白连接酶E3上，对泛素化修饰的特异性和精确时空性起关键作用[6-7]。植物体内的泛素结合酶广泛参与植物的生长发育及对生物和非生物胁迫的响应，如DNA修复、光周期调控、维管发育、缺素胁迫响应以及热激、重金属、干旱和病害等抗逆胁迫[8-12]。

真核生物泛素结合酶是多基因家族编码蛋白，酵母中有11个E2s、人基因组中有50个E2s，拟南芥基因组中有37个E2s[13-14]，目前在NCBI数据库中登录的橡胶树泛素结合蛋白酶基因有6个，但缺少相关基因分子特性及功能方面的研究。在先前构建的乙烯利诱导的SSH文库中，筛选获得1个编码泛素结合蛋白酶的EST序列。本研究在此基础上对该基因编码区cDNA序列和基因组序列进行了克隆，对基因结构、进化和表达特征等进行分析，为深入研究其在橡胶树中的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）热研 7-33-97来自中国热带农业科学院试验场。选取6年生的橡胶树，用1%乙烯利进行诱导，处理方法参考Hao和Wu[15]的方法进行，采集处理后0、3、6、12、24、48 h的胶乳迅速置于液氮中冷冻，-70 ℃保存，同时采集橡胶树树皮、树叶和花等不同组织于液氮中迅速碾磨成粉末，-70 ℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取和cDNA合成 橡胶树胶乳总RNA提取参考张治礼等[16]的方法；其他组织RNA提取参照Kiefer等[17]的方法；叶片DNA提取参考安泽伟等[18]的方法；cDNA第一条链合成采用北京全式金公司反转录试剂盒，具体步骤参见说明书进行。

1.2.2 HbUBC5基因和启动子区的克隆 先前获得的与其他植物泛素结合蛋白酶基因同源性较高的的No. 90 EST序列长度为443 bp，以该序列为探针在NCBI WGS数据库中进行搜索，将搜素结果进行分析和拼接，获得基因的编码区DNA序列和大约1 500 bp的启动区序列。根据拼接结果设计特异引物HbUBCF（5′-GTAATCATGGACATGAGGCCA

AA-3′）和HbUBCR（5′-GATCAGCTCCTAAATAATTA

TCC-3′）对HbUBC5全长cDNA序列和DNA序列进行扩增；引物PHbUBCF（5′-CTCTTCTATACAAGTC

TCTCTCTTG-3′）和PHbUBCR（5′-TTTGGCCTCATGT

CCATGATTAC-3′）对HbUBC5启动子区进行扩增。PCR扩增反应：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物经回收和纯化后，与T载体连接。将连接产物转至DH5a感受态细胞，通过PCR检测确定阳性克隆，送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。

1.2.3 生物信息学分析 用ORF finder分析cDNA序列的开放阅读框；利用在线软件GSDS对基因的外显子/内含子进行界定；蛋白质序列分析在http：//www.expasy.org网站相关软件完成；用DNAMAN软件进行多重序列的比对和系统进化树的构建；利用启动子顺式作用元件预测网站PLACE软件对HbUBC5启动子序列进行分析。

1.2.4 HbUBC5表达分析 提取不同样品的RNA，进行反转录，以18S rRNA作为内参采用康为世纪公司的SYBR Green RT-PCR One Step Kit及 Mx3005P PCR仪进行基因表达水平检测。 用于实时荧光定量PCR的HbUBC5引物为QUBCF（5′-ATCTAGGTG

TGTCAGCATTTCC-3′） 和QUBCR（5′-CCCTCATACA

CAGTTCCCTTTC-3′）；内参引物为Q18SF（5′-GCTC

GAAGACGATCAGATACC-3′）和Q18SR（5′-TTCAGC

CTTGCGACCATAC-3′）。具体反应体系为：模板 0.5 μL，上下游引物混合物1 μL，2×SYBR Premix 10 μL，用水补足20 μL；PCR程序为：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；按默认程序绘制55 ℃至 95 ℃融解曲线。

2 结果与分析

2.1 HbUBC5的克隆与序列分析

利用特异性引物对HbUBC5的cDNA和基因组 DNA进行 PCR扩增，获得与预期目标大小相符的片段（图1）。目的片段经回收、纯化后进行测序，测序结果表明HbUBC5 cDNA长度为567 bp，包含1个558 bp的完整开放阅读框，编码185个氨基酸，编码蛋白的分子量20.91 ku，理论等电点7.60。HbUBC5在基因组中序列长度为2 441 bp，包含6个外显子和5个内含子（图2），外显子和内含子的剪接均符合GT-AG原则。

推导的HbUBC5蛋白具有典型的植物泛素结合酶E2的结构特征，包含1个保守的UBC结构域（划线处）和1个高度保守的半胱氨酸（cysteine）酶活性位点（图3），与蓖麻（Ricinus communis）、黄瓜（Cucumis sativus）、鹰嘴豆（Cicer arietinum）和大豆（Glycine max）中相应的泛素结合酶蛋白的同源性分别为82%、76%、74%和73%，而与橡胶树中已有的泛素结合酶HbUBC1、HbUBC2a、HbUB2b、HbUBC3、HbUBC4和HbE2的同源性分别只有19%、30%、30%、32%、24%和18%。

2.2 HbUBC5的进化分析

根据E2蛋白的结构特征，拟南芥37个E2成员分为12个亚族[13]。将 HbUBC5与拟南芥不同亚族E2蛋白及橡胶树中已报道6个E2蛋白进行序列比对，构建同源进化树。结果显示，HbUBC5与Ⅷ亚族的AtUBC19和AtUBC2处在一个分支上，而HbUBC2a和HbUBC2b与Ⅲ亚族成员聚为一类；HbUBC1和HbE2与Ⅹ亚族成员聚为一类；HbUBC3与XV亚族成员聚为一类；HbUBC4与Ⅸ亚族成员聚为一类；表明HbUBC5与橡胶树中其他E2成员的进化关系较远（图4）。

2.3 HbUBC5启动子序列分析

通过PCR扩增获得了HbUBC5基因翻译起始密码子ATG上游1 482 bp的启动子区（图5），预测分析发现该序列具有真核生物典型启动子结构特征，核心启动子区位于ATG上游-267～-218 bp，其可能的转录起始位点位于翻译起始位点上游 -227 bp处。除了TATA-box和CAAT-box基本元件外，HbUBC5启动子区还含有众多应答激素和胁迫信号元件，如2个乙烯应答元件ERE、1个水杨酸应答元件TCA-element、1个赤霉素应答元件TATC-box、3个热诱导应答顺式元件HSE、1个厌氧应答元件ARE、1个防御和胁迫应答元件TC-rich repeats和2个干旱应答相关元件MBS等（图6）。

2.4 HbUBC5的表达特征

利用实时荧光定量PCR检测了HbUBC5在不同组织中的表达情况，结果显示HbUBC5在所检测的组织中均有表达，但有所差异，其在树皮的表达量最高，在花中的表达量次之，在胶乳和叶片中的表达量相对较低（图7-A）。乙烯利刺激后，胶乳中HbUBC5的表达在处理6 h后显著上调并达到最大，随后恢复到处理前水平（图7-B）。

3 讨论与结论

本研究在橡胶树中克隆了一个新的巴西橡胶树泛素结合酶基因HbUBC5，其编码的蛋白具有典型的植物泛素结合酶结构特征。HbUBC5与其他植物中相应蛋白具有较高的同源性，而与橡胶树中其他E2蛋白的同源性则较低，聚类分析也表明HbUBC5与橡胶树中的其他E2蛋白进化关系较远，这说明不同植物中相应的E2蛋白可能具有类似的结构和功能，而同一植物中不同E2蛋白可能具有不同的生理功能。HbUBC5在所检测的组织中均有表达，说明其可能广泛参与了橡胶树的生长发育。与HbUBC5进化关系较近的拟南芥AtUBC19和AtUBC20已被证实在维持正常细胞功能和细胞周期运转及细胞分化过程中具有重要作用[19]。

植物在抵御环境胁迫、激素响应和衰老的过程中会产生大量的异常蛋白，泛素蛋白酶体途径是降解异常蛋白的重要途径之一，泛素结合酶在这一过程中具有重要的功能[2，8，20]。Picton等[21]研究发现泛素结合酶基因在番茄叶片衰老过程中表达，并认为其在衰老过程中具有重要作用。棉花泛素结合酶基因GhUBC1/2在叶片和花的衰老阶段表达量迅速增加，在棉花衰老的过程中具有重要的调控作用[22]。乙烯是橡胶树胶乳增产刺激剂，已广泛应用于天然橡胶的生产中，但乙烯同时也是一种植物衰老激素，在刺激橡胶树增产的同时也会造成橡胶树早衰和死皮等负面影响[23]。覃碧[24]的研究结果表明，泛素结合酶基因HbUBC22参与了橡胶树乙烯的响应过程，可能在橡胶树产排胶调控过程中具有重要作用。本研究中也发现HbUBC5能被乙烯利显著诱导表达，其启动子区存在2个乙烯响应元件ERE，这说明HbUBC5参与了橡胶树对乙烯的响应过程，并可能参与了乙烯利刺激橡胶树产生副作用的过程。

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