肇莹　肖军　杨镇等

摘要：通过花粉管通道转导芦苇总DNA到水稻辽星1号中，以获得的2个耐盐变异水稻品系H1、H2为材料，对6张叶的水稻幼苗进行0.3%浓度的NaCl溶液诱导处理24 h。提取经NaCl溶液诱导后的叶片mRNA，经反转录成 cDNA，经过酶解后加接头和2次杂交，构建差异表达的抑制消减（SSH）cDNA文库。以NaCl溶液诱导后的耐盐变异水稻H1、H2的cDNA为检测子（tester），以水稻辽星1号cDNA为驱动子（driver）。所构建的文库容量分别达到了240、281个，表明所构建的文库质量良好。对文库中克隆进行测序分析，在NCBI水稻数据库中进行BLAST比对，获得了15个没有同源性的EST序列，其中9个EST序列功能与植物的抗盐性有关，通过RT-PCR技术进一步验证了芦苇总DNA转导到水稻中，使水稻获得了抗盐性。

关键词：水稻；芦苇；抑制消减杂交；cDNA文库；基因表达

中图分类号： S511.01 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0013-04

我国沿海盐渍稻区常利用盐水灌溉，过量施用肥料导致土壤盐分积累以及水稻产量下降[1]。因此，选育耐盐的水稻新品种、充分开发利用盐碱地对于实现农业增收、保障粮食安全具有重要的意义[2-3]。通过生物技术手段可以加速耐盐水稻品种选育进程，但是耐盐目的基因的转入由于存在基因克隆、质粒构建等一系列问题而受到限制。笔者将具有耐盐性状的芦苇总DNA通过花粉管通道法转导至水稻中，经过几代的人工海水筛选获得2个稳定耐盐的水稻品系。抑制消减杂交（suppression subtra ctive hybridization，SSH）技术是一种筛选、分离差异表达基因的方法[4-5]，目前已在小麦[6]、水稻[7-9]、马铃薯[10]、紫秆柽柳[11-12]、杨树[13]等多种植物中得到广泛应用。本研究以2个耐盐变异水稻为材料，构建水稻抑制消减杂交文库，对阳性克隆进行测序，并结合生物信息学对测序结果进行分析，旨在为通过花粉管通道转导芦苇总DNA获得耐盐变异水稻提供可靠的分子生物学证据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为辽星1号水稻转导芦苇总DNA获得的2个耐盐变异品系后代H1、H2，用浓度为0.3%的NaCl溶液对其诱导处理24 h。将处理完的水稻倒数第3张叶片经液氮速冻后保存于-80 ℃超低温冰箱备用。植物总RNA提取试剂盒、Taq DNA 聚合酶、超纯dNTP（10 mmol/L）均购自天根生化科技（北京）有限公司；反转录酶SuperscriptⅢ购自 Invitrogen 生物技术有限公司；pGEM-T easy克隆试剂盒购自Promega公司；LA Taq DNA 聚合酶购自TaKaRa公司；琼脂糖购自西班牙；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Xygen公司；其他生化试剂购自Sigma公司；引物由Invotrigen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 叶片总RNA的提取与纯化

分别取浓度为0.3%的NaCl溶液诱导处理24 h的耐盐变异水稻H1、H2和对照辽星1号叶片100 mg，加入液氮充分研磨成粉末，参照天根生化科技（北京）有限公司植物总RNA提取试剂盒操作说明提取纯化总RNA。对纯化后的RNA进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，观察提取物质量。分光光度计检测RNA样品浓度。RNA样品浓度计算公式如下：

RNA原液浓度（ng/μL）=D260 nm×稀释倍数×40。根据D260 nm/D280 nm比值估测RNA质量。

1.2.2 SSH cDNA文库的构建

采用Invitrogen公司SuperScript Ⅲ Transcriptase反转录酶合成cDNA第1链。以cDNA第1链为模板合成双链cDNA，利用QIAGEN PCR产物纯化试剂盒纯化双链cDNA。采用Rsa Ⅰ限制性内切酶对双链cDNA进行单酶切，酶切后用QIAGEN PCR产物纯化试剂盒进行纯化与浓缩，取5 μL酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。分别以耐盐变异水稻H1、H2为检测子（tester），对照辽星1号为驱动子 （driver）进行SSH杂交，构建耐盐变异水稻特异表达基因的正向cDNA文库。将SSH-PCR纯化产物做TA克隆、蓝白斑筛选，挑选白斑单菌落在37 ℃氨苄青霉素抗性条件下培养，提取质粒以通用引物T7（5′-TAATACGACTCACTC TATAGGG-3′）测序，得到EST序列。将测序得到的EST序列在NCBI水稻数据库中进行核酸BLAST比对。

1.2.3 RT-PCR验证

对SSHcDNA文库中筛选的与水稻cDNA文库查找没有同源性的EST序列设计引物，用Primer Premier 5软件设计引物，由Invotrigen公司合成引物，采用 RT-PCR 技术验证耐盐变异水稻H1、H2差异表达基因。

2 结果与分析

2.1 耐盐变异水稻H1、H2叶片总RNA纯度、质量检测

将提取的耐盐变异水稻H1、H2和对照辽星1号（CK）总RNA用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。由图1可知，28 S、18 S条带清晰。根据条带亮度可以判断，水稻叶片总RNA主要由28 S、18 S组成。同时谱带亮度明显，表明提取的总RNA未被降解，纯度较高。D 260 nm/D 280 nm比值为196，大于1.8。由此可知，提取的耐盐变异水稻H1、H2和对照叶片总RNA纯度较高、质量完整，满足进一步抑制消减杂交的要求。

2.2 双链cDNA合成与酶切电泳检测

1.2%琼脂糖凝胶检测结果（图2）显示，酶切前后条带大小发生明显变化，说明酶切效果很好。未经酶切的双链 cDNA 大小在0.4～10.0 kb之间呈现弥散带型，且在750 bp附近有比较清晰的条带，酶切后的cDNA大小在0.1～2.0 kb呈现弥散带型，且在100、300 bp附近有比较清晰的条带，说明酶切可以充分进行SSH杂交。

2.3 SSH杂交电泳结果

以2次杂交所得产物为模板进行2轮PCR扩增，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶检测，耐盐变异后代H1、H2经第1次消减杂交后，对这些产物进行PCR，结果显示：泳道1、3出现弥散带，并且有主带出现，虽然主带不明显，但也说明差异表达基因已经被均衡消减，达到了去除高丰度基因的目的。在第1次杂交混合物中加入新制备的变性CK cDNA，结果显示，第2轮PCR后在泳道2、4中150、300 bp附近有比较清晰的条带，说明经过第2次抑制消减杂交后，已经富集诱导表达cDNA目的片段（图3、图4）。

2.4 TA克隆及阳性克隆筛选

将第2次PCR扩增产物经QIAGEN PCR产物纯化试剂盒纯化后与pGEM-Teasy载体连接，转化大肠杆菌。对所构建的抑制消减杂交文库进行蓝白斑点筛选并计算重组率[重组率=白色菌落数/（蓝色菌落数+白色菌落数）×100%]，结果显示，耐盐变异水稻H1、H2杂交文库重组率分别为962%、932%。随机挑选的24个阳性克隆均能扩增出单一清晰条带。H1、H2杂交文库插入的片段大小为300～1 000 bp，个别插入片段大于1 000 bp，平均插入片段大小为400 bp。

2.5 SSH文库测序分析

对挑选的经过菌落PCR检测过的差异表达克隆进行测序，以T7（ACGACTCACTATAGGGCTTTTT）为引物。H1文库得到240个高质量的EST序列，H2文库得到281个高质量的EST序列。将测序质量合格的序列去除序列两端载体序列、接头序列后提交到NCBI水稻数据库中进行核酸BLAST比对，结果表明，H1文库有234个EST序列在水稻cDNA数据库中有很高同源性，6个EST序列没有同源性。H2文库有272个EST序列在水稻cDNA数据库中有很高的同源性，9个EST序列没有同源性。将获得的15个与水稻没有同源性的EST序列进行功能比对，其中9个EST序列与植物抗盐性有关，说明通过转导芦苇总DNA获得的水稻H1、H2、辽星1号在基因水平上存在差异，芦苇DNA与抗盐相关的基因片段转导到水稻DNA中从而导致其耐盐性发生改变（表1）。

2.6 引物设计结果

选取4个在水稻cDNA数据库中没有同源性的EST序列与5个具有与抗盐性相关的基因EST序列设计引物（表2）。

2.7 RT-PCR验证

从SSH-cDNA文库中挑选9个阳性克隆进行RT-PCR验证。提取水稻耐盐变异新品种以及对照株的RNA为模板，进行反转录合成cDNA，用上述步骤中合成的特异性检测引物进行PCR扩增，取10 μL PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。RT-PCR扩增后电泳检测，部分结果如图5所示，X177、X137检测引物可从水稻耐盐变异株中扩增出目的条带，对照株辽星1号中没有扩增出特异性条带，表明辽星1号变异品系成功转入了芦苇总DNA。X181、X219、D562检测引物在耐盐变异新品种材料中的表达量较高，条带亮度较为明显，对照株中的表达量较低，PCR条带较暗，目的基因在植株体内表达量不是很高。D23没有扩增出目的条带，说明阳性克隆特异性弱。X205、D546检测引物在辽星1号以及耐盐变异株中均扩增出了目的片段且丰度相同，这是因为消减杂交构建文库时可能没有完全消减掉相同的片段，由此说明抑制消减杂交技术还有待改进。X144在对照辽星1号中扩增出了目的条带而在水稻耐盐变异株中没有扩增出目的条带，表明这个阳性克隆是假阳性。为了验证片段的正确性，片段进行RT-PCR扩增后的PCR产物再次进行测序，将所得的序列与之前的序列进行比对，发现均属于相同的片段。

3 结论与讨论

通过花粉管通道将外源DNA导入整体植物是一种简单易行的生物技术，目前已被广大作物育种工作者用于作物的基因转移[14]。此技术不但在小麦、棉花、水稻上得以利用，而且在大豆[15]、花生、烟草、白菜、茄子[16]、黄瓜等作物上都进行了供体DNA的转移。花粉管通道转基因技术初期阶段是以总DNA为外源基因供体，虽能引起后代发生变异，但对外源DNA进入胚囊、卵细胞或受精卵以及核基因组或细胞质基因组的行为，带有标记基因的质粒或目的基因导入后整合机理，以及引起特定而广泛变异的机制和转化后的表达与调节等问题缺乏理论认识，致使国内外一些学者对其可靠性提出了质疑。自从花粉管通道转基因技术问世，最普遍的疑问是认为变异植株来自种子混杂、异花授粉或自然突变。本研究首次利用SSH技术对水稻通过花粉管通道技术转导芦苇总DNA获得的变异后代H1、H2进行测序研究，最终获得了许多非来源于水稻的表达序列标签。未知基因比例高达300%、34.5%，这些未知基因可能来源于供体芦苇DNA片段与水稻合成相关的新基因。这些EST为最终阐明通过花粉管通道转导芦苇总DNA获得耐盐变异后代机制提供了直接可靠的分子生物学证据。

3.1 RNA样本的制备

构建一个高质量的全长cDNA的前提是能提取到结构完整、纯度高的总RNA，否则就不能保证所构建的文库涵盖90%以上的基因。RNA提取的过程中，应该创造一个无RNaseA的环境，防止RNA降解，并且选择一种既简单又快捷的提取RNA的方法。本研究获得的总RNA质量完整，纯度较高，为构建高质量的耐盐变异后代H1、H2的cDNA文库奠定了良好的基础。

3.2 对SSH各个环节进行实时监控

本试验抑制消减杂交过程中，由反转录合成cDNA及 RsaⅠ 酶切的检测，到加接头后的接头连接效率分析直到进行消减cDNA片段的消减效率分析，都要对各个试验环节进行随时监控，以保证最终能得到高质量的差异表达cDNA文库。接头连接效率同整个试验效果直接相关，接头连接后，要进行接头连接效率检测。

3.3 阳性克隆的鉴定

菌斑培养的方法是抗生素、蓝白斑筛选，一般情况下，使用抗生素筛选则空载体不能成活。蓝白斑筛选可以判断目标片断是否插入到载体中，白斑或者浅蓝斑表示该菌落质粒中已经含有目标片断。为了能够更准确地判断该克隆是否是有水稻诱导后特异表达的基因（正交库）或者诱导后不表达或者表达量减少的基因（反交库），应当进一步进行菌落PCR鉴定，对目标基因的特异性进行验证。

3.4 EST序列的分析

RT-PCR把以RNA当作模板的cDNA合成同PCR结合在一起，是一种快速灵敏的分析基因表达的方法，主要应用于对表达信息进行检测，除此之外还可以用来检测基因表达的差异，相比于其他包括RNase保护分析、Northern印迹、原位杂交以及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术更加灵敏，更加便于操作。本试验利用RT-PCR差异片段进行扩增，可以有效避免DNA扩增过程所带来的内含子的影响，从而可以更高效、快速地验证差异片段的正确性。

3.5 EST序列的分析

泛肽（ubiquitin）是存在于真核细胞中含有76个氨基酸残基的高度保守序列的小肽。泛肽途径是真核细胞选择性降解蛋白质的1种级联反应途径，不但能降解变性的、异常的或短命的蛋白，还能降解植物色素、内膜蛋白、细胞周期蛋白等天然蛋白、转录因子，因而在转录水平的调节、蛋白的降解、蛋白稳定状态的调节、程序性细胞死亡、细胞周期的控制等过程中有重要作用。泛素类蛋白被各种胁迫所诱导而表达且该家族成员对胁迫反应是相互独立的。菜豆泛肽基因能响应高温、水杨酸、病毒侵染等胁迫，表明菜豆的泛肽水解途径在清除胁迫条件下累积的损伤蛋白和介导植物的抗逆性具有重要作用。本研究所获EST序列（登录号：NM_001156199.1）与玉米泛素结合酶、EST序列（登录号：XM_002265287.2）的同源性较高。盐胁迫对光反应的影响主要是对光系统Ⅰ（PSⅠ）、光系统Ⅱ（PSⅡ）以及电子传递的影响，通常认为PSⅡ是光抑制的原初位点及主要作用部位。PSⅡ能介导非循环电子传递，而且是进行水光解放氧的部位，在光合作用响应环境胁迫中起着极为关键的作用。本研究所得到的EST序列（登录号：XM_002518218.1）与蓖麻PSⅡ叶绿素a P680假定蛋白的同源性较高。有学者认为，逆境胁迫下蛋白水解酶活性上升同清除因胁迫而产生的畸变蛋白（aberrantproteins）有关。研究表明，大麦根系蛋白水解酶活性在盐胁迫处理下下降，这可能是因为形成了具有蛋白酶抑制剂作用的盐适应蛋白，在盐胁迫条件下维持根系中较高的蛋白质含量。本研究所获EST序列（登录号：XM_003580628.1）与二穗短柄草的ATP依赖的Clp蛋白水解酶的同源性较高。

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