曾娟妮刘筱伍伟明尹婷吴志荣李文华

【摘要】目的：探讨外用单味动物药促进创面愈合的机制。方法：将50只大鼠分为急性创面组、模型组、贝复济组、美洲大蠊提取液组，用RT-PCR实验方法，观察大鼠皮肤修复组织VEGFmRNA的表达。结果：VEGFmRNA的表达在第5、7、11天，急性愈合创面组VEGFmRNA的表达量显著高于美洲大蠊提取液组、贝复济组及模型组（P<001）；在第5、7、11天，美洲大蠊提取液组、贝复济组VEGFmRNA的表达量显著高于模型组（P<001）；在第5、11天，美洲大蠊提取液组与贝复济组VEGFmRNA的表达量有统计学差异（P<005）；第7天，肉芽组织生长期，美洲大蠊提取液组与贝复济组VEGFmRNA的表达量无统计学差异（P>005）。结论：美洲大蠊提取液通过提高VEGFmRNA的表达来促进创面愈合。

【关键词】美洲大蠊提取液；慢性难愈合创面；RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）；基因表达

【中图分类号】R2855【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）19-0064-03

慢性难愈合创面是指创面在各种内外因素作用下不能通过正常的愈合进程达到解剖和功能上的完整，从而进入一种病理性炎症反应状态，最终导致经久难愈。药理研究证明美洲大蠊提取物能促进肉芽组织生长，促进血管增生，加速坏死组织脱落，迅速修复各类溃疡及创伤创面；抗感染、消除炎性水肿，提高机体免疫功能；外用可快速激活局部免疫细胞，缩短创面愈合时间[1-2]。目前，美洲大蠊提取物被广泛应用在创面修复、胃溃疡、肿瘤等领域[3-4]。笔者前期将美洲大蠊提取物外用于肛管难愈合创面，并取得满意疗效[5]。但其促进慢性难愈合创面的机制尚未探讨。因此本实验研究从创面愈合机制为出发点，以RT-PCR为主要研究方法，从肉芽组织中新生血管为切入点，通过动物实验从局部生长因子等角度探讨美洲大蠊促进创面愈合的机制提供理论依据，并为中医药的外治提供新思路。

1材料与方法

11实验动物及分组实验动物SPF级50只大鼠，2月龄，体重200～250g，雌雄不限“均由湖南中医药大学动物中心提供，混合饲料单笼饲养”，50只大鼠随机分组，先取12只建立大鼠急性愈合创面模型，其余38只建立大鼠慢性难愈合创面模型，慢性难愈合创面组再随机分为模型组、贝复济阳性组（国药准字Z20013152，实验全过程使用同批号药物）、美洲大蠊提取液实验组（国药准字Z20000004，实验全过程使用同批号药物）。

12大鼠慢性难愈合创面模型建立参照付小兵等[6]全层皮肤缺损法经改进制成大鼠慢性难愈合创面模型。

13主要实验试剂Trizol：Invitrogen；Real-time PCR mix：Promega A6001；DNA Marker：Fermentas；异丙醇：上海化学试剂公司；氯仿：上海化学试剂公司；引物：上海生工；Gold View核酸染料：上海生工；琼脂糖粉：上海生工。

14主要实验仪器及耗材台式高速冷冻离心机：美国Thermo；核酸蛋白分析仪：德国eppendorf；PCR仪：德国 Biometra；凝胶成像分析仪：美国Bio-Rad；微量移液器：德国eppendorf。

15实验方法及步骤

151引物设计从NCBI中下载以下基因序列，引物设计采用Primer50软件，引物序列见表1。

152RNA提取及逆转录从组织中提取RNA并反转录得到cDNA，并以该cDNA为模板，用针对目的基因设计合成的QPCR引物进行real-time PCR，以检测组织中目的基因的表达。组织中总RNA抽提：①取50～100mg组织，每孔加入1000μL Trizol，吹打，室温静置5min；②每管加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温静置3min；4℃，12000rpm，离心15min；③从每管中吸取上清至另一新的15mL EP管。加入等体积异丙醇，混匀后室温静置20min；④4℃，12000rpm离心10min后，去上清；加入至少1mL 4℃预冷的75%乙醇，洗涤沉淀；⑤4℃，10000rpm离心5min，弃上清；4℃，10000rpm再次离心5min，吸去残液，室温干燥（不需完全干燥）；⑥加入20μL RNase-free水，至完全溶解，备用。

15312%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA纯度。

154第一链cDNA合成 ①取10μg Total RNA加Nuclease-Free Water到无RNA酶的EP管中，混匀后离心，70℃温浴10min，立即置于冰上；②加一下反应体系的其他试剂（冰上进行），混匀，短暂离心。③上述体系在42℃反应15min，然后在70℃水浴锅中水浴10 min使Reverse Transcriptase失活。④将得到cDNA 置于-20℃保存备用。

155普通PCR检测（德国，biometra） 按下列比例配置反应体系：①2×Real-time PCR mix/2×PCR mix：10μL；②PCRmix；③cDNA模板：1μL ④上游引物：1μL；⑤下游引物：1μL；⑥ddH2O：7μL；⑦总体积：20μL；⑧扩增程序94℃，4min；94℃，40sec，60℃ 30sec，×40cycle。

16统计学方法实验数据用SPSS160统计分析软件处理，计量资料以均数加减标准差（x[TX-*3]±s）表示，行t检验，P<005为差异具有统计学意义。

2结果

2112%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA纯度

22VEGF电泳结果

图2注：GAPDH电泳图， 第 1、2、3泳道是急性愈合创面组，4、5、6泳道是模型组， 7、8、9泳道是贝复济组，10、11、12泳道是美洲大蠊提取液组。

图3注：VEGF mRNA表达电泳结果，第1、2、3泳道是急性愈合创面组，4、5、6泳道是模型组， 7、8、9泳道是贝复济组，10、11、12泳道是美洲大蠊提取液组，可反映出VEGFmRNA的表达量从高到低依次是急性愈合创面组、贝复济组、美洲大蠊提取液组、模型组，在第7天，美洲大蠊提取液组与贝复济组的VEGFmRNA的表达量无明显差异。

23结果（见表2）

3讨论

31本实验研究发现在第5天、第7天、第11天，急性愈合创面组VEGFmRNA的表达量显著高于美洲大蠊提取液组、贝复济组及模型组（P<001），表明造模成功；在第5天、第7天、第11天，美洲大蠊提取液组、贝复济组VEGFmRNA的表达量显著高于模型组大鼠（P<001）；在第5天、第11天，美洲大蠊提取液组比贝复济组VEGFmRNA的表达量稍低，但差异不明显（P>005）；在第7天的肉芽组织生长期，美洲大蠊提取液组与贝复济组VEGFmRNA的表达量无差异（P>005）；表明美洲大蠊提取液在创面肉芽生长期能诱导内源性VEGF的基因表达，促进细胞外基质（ECM）形成并减少效应T细胞在组织局部蓄积的作用，促进创面血液循坏、增强创面免疫力，从而促进创面修复、抑制瘢痕生长。

32血管生成可为创面的修复提供充足的氧分，有利于细胞的增殖；新生血管是肉芽组织的主要成分，肉芽组织是胶原沉积、改建的场所，因此，血管新生是创面修复过程中重要的一环[7]。血管内皮生长因子（VEGF）是一种特异的直接作用于内皮细胞的有丝分裂原，可以刺激体内尤其是缺血部位的血管生成，是迄今为止已知的最强烈的促血管生长因子，它主要是通过启动微血管发生的初始过程-出芽，并最终形成成熟的血管结构[8]因此，VEGF在皮肤溃疡愈合过程中起决定性作用。在慢性创面，由于VEGF表达较正常创面下调而导致血管生成的下降，被认为是慢性创面难愈合的重要原因[9]。基于此，本实验通过检测肉芽结果中VEGFmRNA的表达来探讨单味动物中药对促愈具有非常重要的意义，但美洲大蠊提取液在创面重塑期与贝复济组表达有差异，那么它是否能减少瘢痕的形成有待于进一步探讨。

参考文献

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[9]彭湃.VEGF在慢性创面愈合中的作用及机理研究[D].广州：第一军医大学，2004.

（编辑：穆丽华）