商雨等

摘 要 以昆明地区传统栽培的白花马蹄莲和彩色马蹄莲Ym035（橙红复色）、Ym005（红色）、Ym088（金黄色）、Ym002（浅粉色）和Ym064（紫红色）为试验材料，进行远缘杂交，对杂交组合和结实率进行分析，探索远缘杂交的亲和性；设计4组不同激素组合，对杂交白化苗后代幼胚进行胚拯救，探索最适于白化苗幼胚萌发的激素配比。结果表明，彩色马蹄莲做母本，结实率高于白花马蹄莲，白花马蹄莲地栽植株比盆栽的更为健壮，最佳组间杂交组合为：Ym002×白花马蹄莲（地栽），彩色马蹄莲组内杂交以Ym005×Ym035杂交亲和性较高；远缘杂交白化苗后代幼胚萌发的最适培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

关键词 马蹄莲；远缘杂交；白化苗；胚拯救

中图分类号 S682.2 文献标识码 A

Abstract The cultivars of colored Zantedeschia hybrid： Ym035， Ym005， Ym088， Ym002，Ym064 and Zantedeschia aethiopica were used as the experimental materials. The setting rate of seeds was analyzed to find the best crossing combinations. Albino hybrids between Z. aethiopica and colored Z. hybrid were obtained by embryo rescue. Four different media were designed to explore the best one for embryo rescue. The results showed： the colored Z. hybrid was better as female parent than Z. aethiopica， and the best crossing combination was Ym002 × Z. aethiopic. Z. aethiopic planted in the ground was more vigorous than that planted in the pots. For the crossings in the Aestivae section， the combination of Ym005 × Ym035 had a higher affinity. MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L was the best media for embryo rescue of the albino hybrids from intersection hybridization.

Key words Zantedeschia spp.； Interspecific crossing； Albino seedling； Embryo rescue

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.002

马蹄莲（Zantedeschia spp.）为天南星科（Araceae）、马蹄莲属（Zantedeschia）多年生草本球根花卉。马蹄莲属包括两个组：Zantedeschia组和Aestivae组。Zantedeschia组茎叶原产地冬季不落叶，具有长形、有分支的地下茎，花为白色，被称为白花马蹄莲[1]。Aestivae组茎叶冬季枯萎、种球具有冬季休眠的特点，佛焰苞彩色，称为彩色马蹄莲[2]。马蹄莲，尤其是彩色马蹄莲，花型独特、色彩艳丽、花叶具赏，不但是极好的切花素材，盆花也受到消费者的广泛喜爱，被誉为21世纪“花卉之星”。

彩色马蹄莲虽然具有较高的观赏价值和较好的市场前景，但由于其自身极易感染由欧文氏菌（Erwinia carotovora subsp. carotovora，现改名为Pectobacterium carotovora subsp. carotovora胡萝卜软腐果胶杆菌）引起的细菌性软腐病而导致大面积死亡[3]，加之目前主要依赖进口的彩色马蹄莲种球价格昂贵，导致彩色马蹄莲难以推广种植，极大的限制了彩色马蹄莲的发展。与彩色马蹄莲不同，白花马蹄莲对欧文氏软腐细菌天生具有高抗性[4]。但由于核质不相容障碍（Plastome-genome incompatibility，PGI），白花马蹄莲和彩色马蹄莲种间杂交得到的均为白化苗[5]，限制了白花马蹄莲的抗性基因渗入到彩色马蹄莲中。因此研究马蹄莲PGI障碍所导致的种间杂交后代白化机制，可以为克服彩色马蹄莲细菌性软腐病提供新的思路。

已经有许多被子植物被报道有核质不相容障碍，其中以马蹄莲[6]、月苋草[7]、杜鹃[8]中发生的最为普遍。白化是植物育种，特别是远缘杂交中常见的现象[9]。Yao等[10]曾经对马蹄莲白化苗进行抗病性检测，从中筛选异养条件下的抗性杂种。远缘杂交对创造更为丰富的遗传变异提供了可能性，国内马蹄莲的杂交育种研究，多集中于组内杂交，组间远缘杂交、杂交亲和性研究尚未见报道。杂交后代败育是远缘杂交育种难以进行的主要障碍之一[11]。由于缺乏叶绿素，白化后代不能进行光合作用，往往于种子萌发几天之后死亡。利用胚拯救技术成功获得离体白化苗，是研究白化苗特性和白化机制的重要基础。利用胚拯救技术可以使原本不能正常结实的杂交组合获得后代。胚拯救技术目前较常用于果树栽培方面的研究，马蹄莲由于杂交后代常败育，也较常使用胚拯救技术获得大量材料[12]。

本试验以白花马蹄莲和5个不同彩色马蹄莲品种为亲本，进行远缘杂交，探索马蹄莲远缘杂交亲和性；运用胚拯救技术成功获得杂交后代的同时，探索白化后代幼胚离体生长的适宜培养基配方，为马蹄莲远缘杂交育种及PGI障碍导致的种间杂交后代白化机制的研究提供试验材料和技术支持，从而为进一步的育种目标——培育马蹄莲抗病新品种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料 白花马蹄莲为昆明地区传统栽培的白花马蹄莲品种，彩色马蹄莲品种主要由亚欧园艺花卉公司提供，其中除马蹄莲白花（地栽组）为地栽外，其它所有材料均为盆栽，所有彩色马蹄莲品种均为市场流行的栽培品种，且前期试验表明自交结实率较高。

1.1.2 主要仪器和试剂 解剖刀、育种专用套袋、酒精灯、超净工作台、镊子、烧杯、玻棒等玻璃试剂仪器。MS培养基所需试剂、6-BA、NAA、75%酒精、2% NaClO、蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 去雄 当马蹄莲雌蕊柱头略有突起，开始分泌少量黏液时去雄。用蘸过75%酒精的解剖刀将整个肉穗花序上的雄蕊切除，并将切除的雄蕊置于玻璃培养皿中。在干燥情况下，2～3 d后雄蕊会分泌花粉。对分泌的花粉进行收集，一般干燥条件下，花粉活力可以维持7 d，但最好不超过5 d进行杂交授粉。

1.2.2 杂交 去除雄蕊的马蹄莲2～3 d后，雌蕊开始分泌黏液，此时进行杂交。医用棉棒蘸取适量花粉，均匀的涂抹在雌蕊柱头上，使柱头的每个突起均有花粉黏液。试验主要进行两类，一类是马蹄莲白花组和彩色组杂交，需在白花马蹄莲柱头涂抹彩色马蹄莲花粉，彩色马蹄莲柱头涂抹白花马蹄莲花粉，将6个不同品种分为8组，每组均设正反交实验，共16个杂交组合（Ym005由于品种数量不够，没有加入组间杂交试验）；另一类是马蹄莲彩色组间杂交，选取不同品种彩色马蹄莲进行杂交，并注意正反交5个不同彩色马蹄莲品种共20个杂交组合。具体杂交情况见表1、表2。杂交授粉结束后，用育种袋对花朵进行套袋处理，防止其他花粉的干扰。一般授粉两周后，果实开始膨大，60 d后可以开始采摘进行下一步试验。

1.2.3 胚拯救 试验材料为马蹄莲组内杂交后代果实，彩色马蹄莲组间杂交未产生白化苗，本试验仅采用白化苗后代作胚拯救材料。将果实采收后，用洗衣粉清洗干净，蒸馏水中浸泡30 min后置于超净工作台内。无菌条件下，75%的酒精浸泡约30 s，取出后放于2%的NaClO中消毒10 min左右。消毒结束后，无菌水清洗3遍，将果实表面擦拭酒精，在酒精灯上灼烧约30 s，至果实表面子房微微皱缩即可。

外植体消毒结束后，小心取出包裹于子房内的胚珠，再用手术刀轻轻剥离珠被，注意不要伤害到幼胚。去除珠被后，可将幼胚置于培养皿中，幼胚褐色生长点必须向上。本试验培养基配方总共有4种，每种培养基接种25瓶，每瓶接种幼胚2个。具体配方及萌发情况见表3。

上述培养基均在普通MS培养基基础上，添加蔗糖30 g，琼脂粉6.3 g。接种后置于温度25 ℃，光照40 μmol/（m2·s）的培养室内培养。

2 结果与分析

2.1 杂交亲和性及结实情况

2.1.1 马蹄莲组间杂交不同母本类型结实率差异

不同组别正反交结实情况见图1，不同母本类型总体结实率情况见图2。由图1、图2可以看出，白花组作为母本的杂交组合，结实情况不如彩色组为母本。除F组外，其余组别彩色马蹄莲为母本时的亲和性均比白花马蹄莲为母本时好。以白花马蹄莲为母本的杂交组合，总结实率为17.5%，而以彩色马蹄莲为母本的杂交组合总结实率高达25.6%。两者之间差异显著。杂交进行14 d后，彩色马蹄莲为母本的杂交组合开始出现雌蕊膨大现象，白花马蹄莲作为母本的杂交组合20 d以后膨大。白花马蹄莲为母本的杂交组合，杂交后50 d即可进行胚拯救，彩色马蹄莲胚拯救的最佳时期则需要60～70 d，不同成熟时间不会影响胚拯救结实率。

2.1.2 栽培方式对白花马蹄莲杂交结实率的影响

白花组做母本的杂交组合，不同栽培方式的结实率有较大差异（图3）。

以白花（盆栽）作为母本的杂交组合大多败育，结实率只有11.8%。而以白花（地栽）作为母本的杂交组合结实情况相对较好，结实率有20%。

2.1.3 组间杂交彩色组做母本品种间结实差异

彩色马蹄莲做母本，不同杂交组合间的结实情况见图4。

以彩色马蹄莲作为母本的杂交组合，结实率都比较好，Ym002作母本结实率最高。橙红复色品种Ym035为母本的杂交组合中，早期膨大明显，但后期多败育。Ym088纯正金黄色的品种，大部分由于软腐病而未结实。Ym002是花色接近白色的粉白色品种，结实率最高。Ym064为深紫色马蹄莲品种，所结果实比其他品种大，便于后期胚拯救的操作。

2.1.4 彩色马蹄莲组内杂交母本结实情况 彩色马蹄莲组内杂交其母本结实情况见图5。

在进行彩色马蹄莲组内杂交试验过程中，各杂交组合之间结实率差异较大。Ym005与橙红复色的Ym035为母本，结实率最高，分别为61.3%和41.4%。Ym005品种资源较少，已逐渐退出市场，Ym035结实率高主要是由于品种粗壮，不易感染软腐病。而Ym088是最容易感染软腐病的品种，其结实率只有17.4%。Ym064和Ym002为母本的杂交组合，结实率分别为21.6%和28.6%。

2.2 不同激素对杂交幼胚萌发的影响

在选择的4种不同的激素水平中，对比6-BA含量不同，NAA含量相同的Ⅰ、Ⅳ组和Ⅱ、Ⅲ组发现，6-BA量的多少对幼胚的萌发起着关键作用，6-BA含量为1.0 mg/L的培养基萌发率显著多于0.5 mg/L。从NAA含量不同，6-BA含量相同的Ⅰ、Ⅲ组和Ⅱ、Ⅳ组可以看出，NAA含量增加从一定程度上增大幼胚的萌发率，但效果没有6-BA明显。萌发率最高的培养基配方为6-BA添加1.0 mg/L，NAA添加0.1 mg/L，萌发率高达74%（表3）。

幼胚接种后大约14 d开始萌发，白花马蹄莲为母本的幼胚萌发时间比彩色马蹄莲为母本稍早。萌发约80 d后，可以进行正常转接。为了转接后植株的生长，培养基可适当增加6-BA的含量。离体培养3代后，马蹄莲白化苗数量见表4。

3 讨论与结论

3.1 马蹄莲杂交亲和性的不同

研究结果表明，在相同条件下，彩色马蹄莲作为母本杂交亲和性高于白花马蹄莲。同一杂交亲本不同正反交试验中，除Ym088外，其余彩色马蹄莲品种做母本结实率均高于白花马蹄莲，说明彩色马蹄莲相较于白花马蹄莲，雌蕊的生长活性更强。这可能是由于供试的几个彩色马蹄莲品种均为经过多次改良、自交结实率高的品种。

彩色马蹄莲为母本的杂交组合都有较好的结实率，以Ym002为母本的结实率最高。Ym002为最接近白色的粉白色品种，与白花马蹄莲亲缘关系较近可能是杂交结实率相对较好的原因。Ym088植株较易感染软腐病，不建议作为马蹄莲白化苗的母本选择。Ym035抗病能力最强，但试验中频繁出现授粉初期雌蕊膨大较为明显，但后期不继续发育的现象。可能是由于花粉只与卵核或极核发生单受精所致[13]。另外，即使在使用进口盆栽基质的情况下，地栽白花马蹄莲的结实情况还是远好于盆栽白花马蹄莲，可能是白花马蹄莲根系发达，地栽条件为其提供了充分的生长空间。

颜色也是彩色马蹄莲原种分类的主要依据之一[14]，本试验选择不同颜色的彩色马蹄莲作亲本，所有杂交组合中未产生完全白化苗。说明彩色马蹄莲栽培品种经过多次组合杂交后，聚合了多个亲本的基因，已无法从颜色判断其遗传组成、将其作为杂交亲本组合的依据。寻找更好的鉴别方法，如现代分子标记技术等，将是促进马蹄莲育种的有效方法。彩色马蹄莲组内杂交，粉色的Ym002和具有相对较好抗软腐病能力的Ym064杂交亲和性较差；Ym005品种具有较高的杂交亲和性；Ym035作为市场的新宠，也有较高的杂交亲和性。

3.2 不同激素对白化苗幼胚萌发率的影响

不同激素对白化苗幼胚离体培养的效果影响很大。通过试验表明，在MS培养基中附加1.0 mg/L的6-BA和0.1 mg/L的NAA最适宜白化苗幼胚萌发，6-BA对白化苗幼胚培养萌发率的影响要远高于NAA，试验结果与彩色马蹄莲胚拯救[12]结果相似。但关于更多激素种类及浓度对白化苗生长的影响还需进一步试验探索。

胚拯救技术在外源供给营养的条件下，使不能自养的白化苗在较短时间内迅速扩繁，数量增加90多倍。试验结果表明，外源供给营养的条件下，马蹄莲白化苗的生长速度与分化情况与普通绿色苗无明显差异，这一发现为PGI障碍导致的马蹄莲远缘杂交后代白化机制的认识提供了重要启示，胚拯救技术获得了离体培养的白化苗，不但为其白化分子机制的研究提供了材料，也对克服马蹄莲核质不亲和障碍进而创造兼具抗性和观赏性的新品种具有重要意义。

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