程道宾， 陈小武

14-3-3蛋白与α-synuclein在结构上具有同源性，二者能相互作用并共存于Lewy体，提示14-3-3蛋白参与了帕金森病的发病［1，2］。研究发现14-3-3基因转移对多巴胺能神经元具有保护作用［3～5］。LRRK2(leucine-rich repeat kinase 2)与家族性及散发性帕金森病均有关［6］，然而LRRK2突变致帕金森病的机制仍不十分清楚。研究发现14-3-3蛋白亦与LRRK2相互作用［7］，它们的相互作用在帕金森病的发病中有何作用及意义尚不完全清楚。因此本实验拟通过过表达14-3-3γ蛋白，探讨14-3-3蛋白与LRRK2相互作用在帕金森病发病中的作用及机制。

1 材料和方法

1.1 Ad/14-3-3γ的构建、鉴定、扩增与滴度测定 Ad/14-3-3γ的构建与鉴定详见文献［8］。病毒储存液在HEK293细胞(Clontech公司)中进行反复扩增，按Graham的方法［9］对重组腺病毒Ad/14-3-3γ上清采用氯化铯(CsCl)密度梯度离心法和透析法纯化，采用改进的TCID50法检测病毒滴度。病毒滴度用蚀斑形成单位(plaque forming unit，pfu)/L表示，测得重组的Ad/14-3-3γ滴度为3.0×1012pfu/L。

1.2 PC12细胞的培养及实验分组 野生型大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)CCTCC。细胞接种于含5% 胎牛血清(Gibco)、10% 马血清(Gibco)的高糖DMEM培养基(Gibco)中，培养条件为37℃、5%CO2及饱和湿度，2～3d换液，生长至70% ～80%丰度时，吹打细胞传代。

按处理不同实验分为3组:(1)正常对照组:PC12细胞不加任何药物处理;(2)鱼藤酮组:PC12细胞加入新鲜配置的鱼藤酮(终浓度为20nmol/L，Sigma公司)培养48h;(3)Ad/14-3-3γ组:用重组腺病毒Ad/14-3-3γ按感染复数MOI:25感染PC12细胞，48h后加入新鲜配置的鱼藤酮(终浓度为20nmol/L)培养48h。

1.3 RT-PCR 检测14-3-3 γ mRNA 表达 分别提取Ad-null和Ad/14-3-3 γ感染的PC12细胞及未加任何处理的PC12细胞总RNA，逆转录和PCR，以β-actin作为内参照。14-3-3γ引物由上海生工合成。上游引物序列为:5’GGAGGGTCATCAGTAGCATT3’，下游引物序列为:5’GCCAGGTAGCGGTAGTAGTC3’;合成的片段长度226bp。β-actin引物上游序列为:5’GTGGGCCGCTCAAGGCACCAA3’，下游序列为:5’CTTTAGCACGCACTGTAGTTTCTC3’，引物片段长度 540bp。……