闫西刚， 贡志刚， 张荣俊， 兰 青

近年来对BMSCs体外诱导分化的研究已经取得了极大的进展，但有关分化机制的许多问题仍没有解决，特别是有哪些基因参与了诱导分化的调控，每种基因在调控中起到何种作用等一系列问题仍没有得到解决。为了在基因水平上进一步研究BMSCs诱导分化的机制问题，本实验借助Affymetrix基因芯片对BMSCs分化过程中的基因表达情况进行研究，试图找出与神经元分化密切相关的基因，一方面从分子水平验证其向神经元分化的能力;另一方面也为BMSCs的基因工程改造提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物与材料 动物:成年近交系Wistar大鼠(＞36代)，雌雄不限，体质量约300克/只(中国科学院上海实验动物中心提供)。试剂:DMEM(Gibco公司)、F12(Gibco公司)、胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)、淋巴细胞分离液(密度为1.077g/L，上海试剂二厂)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor bFGF，Sigma公司)、表皮生长因子(epidermal growth factor EGF，Peprotech公司)、山羊血清(PAA公司)、Triton-X-100(Sigma公司)、联脒二苯吲哚(DAPI，Sigma公司)、兔抗CD44抗体(武汉博士德生物工程有限公司)、小鼠抗兔CD45单克隆抗体(Caltag公司)、兔抗β-Tubulin III抗体(Corance公司)、兔抗GFAP抗体(DAKO公司)、Alexa Fluor 488标记羊抗兔IgG(Molecular Probes公司)、Cy3标记羊抗小鼠IgG(Dianova公司)。仪器:CO2细胞培养箱(ESPEC BNA-311)、倒置相差显微镜(XDS-1B)、激光共聚焦显微镜(Ziess LSM410);Affymetrix U133 plus 2.0基因表达谱芯片(上海生物芯片有限公司提供)。

1.2 方法

1.2.1 关于BMSC BMSC的取材、细胞培养、诱导分化及免疫细胞化学鉴定详见文献报告［1］。

1.2.2 总RNA的提取和基因芯片杂交 按Trizol试剂盒说明采用一步法从组织样本中抽提总RNA，RNeasy Mini Kit进行纯化。抽提的 RNA用1%的DEPC溶解后在紫外分光光度仪下测定RNA的浓度和纯度，同时凝胶电泳检测RNA有无降解。按Super-ScriptⅡ试剂盒操作说明反转录成cDNA，然后用RNA转录标记试剂盒进行转录合成cDNA探针，合成的同时进行生物素标记;生物素标记的cDNA探针经片段化处理后与基因芯片(Affymetrix Rat Expression Array230 2.0)在杂交炉 640中45℃杂交16h，然后于基因芯片流程工作站400中洗脱、染色。最后用GeneArray扫描仪扫描杂交信号。

1.2.3 芯片数据处理 杂交后的芯片经Gene array Scanner3000 7G扫描仪读取数据点后计算得出一个显著性P值。采用GCOS软件比较计算两张芯片上同一探针的信号值得到显著性差异P值，根据统计学定义，P值差异在0～0.002之间的，认为基因表达为上调(Increase I);在0.998 ～0.999 之间的认为是表达下调(Decrease D);0.003～0.997之间的认为该基因的表达量在所比较的两张芯片实验结果中没有变化(No Change NC);位于两个区间0.002～0.003和0.997 ～0.998 内的属于临界状态(Marginal Increase MI;Marginal Decrease MD)。进一步结合另2个严格标准，最终可靠地筛选出上调(Up)和下调(Down)基因。上调(Up)或下调(Down)需同时满足以下3个标准，上调(Up):Signal Log Ratio＞ =1，实验组 Detection为 P，Change为I或 MI;下调(Down):Signal Log Ratio＜ = －1，对照组Detection为 P，Change为 D 或 MD(注:Signal是扫描仪检测出的光强度经过Normalize后的数据;Detection分为P、A和M 3种，P代表Present，A代表Absent，M代表Marginal;Signal Log Ratio指实验组和对照组比值取Log2后的值)。

2 结果

2.1 BMSCs的培养、传代 原代的BMSCs呈贴壁生长，细胞生长缓慢，形态多样，胞体呈梭形、椭圆形、三角形、不规则形。传至第3代时，细胞形态趋于一致，大部分细胞呈长梭形，细胞密集生长处呈现旋涡状、菊花状、辐射状。传代后的细胞生长迅速，3～4d即可长满瓶底。至3代以后，细胞形态趋于一致。

2.2 BMSCs免疫表型鉴定 CD44抗原是BMSCs表面标志性抗原之一，免疫细胞化学荧光染色显示，BMSCs经CD44抗体染色后可见大量呈绿色的CD44阳性细胞。第四代BMSCs的CD44阳性率最高为(95.23 ±3.06)%。

2.3 BMSCs的诱导分化 BMSCs诱导72h后，大部分细胞发生形态改变，伸出类似神经元样的突起，突起之间相互连接，形成广泛的网络样结构。4d后细胞发生形态改变的趋势减缓，7d后几乎已无细胞发生形态改变。

2.4 BMSCs诱导分化后的免疫细胞化学鉴定分别对诱导1～7d的细胞行幼稚神经元标记物β-TubulinIII、星形胶质细胞标记物GFAP染色，发现随着诱导时间的延长β-TubulinIII阳性细胞以及GFAP阳性细胞数逐渐增加，至第7天时达到最高，分别为(75.43 ±7.63)%和(33.01 ±6.73)%。

2.5 Scatter散点图 芯片杂交后的扫描图。其中散点图的X轴为对照组的信号值，Y轴为实验组的信号值，图中红色的点为实验组和对照组该基因的Detection均为P，蓝色的为两组中有一个值不是P的，而黄色的点为两组均为A。散点图中共有8条斜线，它们由上往下为 30、10、3、2、－2、－3、－10、－30，筛选出来的差异基因应该在2和－2线外。

2.6 芯片检测结果 实验得到0d，7d两张基因芯片。在0d和7d的芯片表达谱中共发现差异基因97条(本文不具体列出)，其中上调基因62条，下调基因35条。通过文献检索，发现有24条基因与神经元发育相关，其中经诱导后表达上调的基因有18条(见表1)，表达下调的有6条(见表2)。

表1 BMSCs诱导后表达上调的与神经元发育相关的基因

表2 BMSCs诱导后表达下调的与神经元发育相关的基因

3 讨论

BMSCs是存在于骨髓中除造血干细胞外的另一种干细胞。近年来的研究显示，BMSCs可在体内、体外诱导成为神经元样细胞［2］，并能增殖和具有神经细胞的一些功能，加之其来源丰富，取材简便，易于分离纯化培养，在一定条件下可在体外迅速扩增，且自体移植克服了伦理和免疫排斥的问题［3］，因此有望成为神经系统疾病的细胞替代疗法和基因治疗的载体［2］。但它同样也面临着许多棘手的问题。BMSCs定向分化为神经元样细胞的过程比较复杂，其多潜能性决定了它的分化调控机制的复杂性，如何弄清其分化机制问题，以便我们通过人工干预的手段促使其更好的向神经元方向分化，是我们亟待解决的问题。基因芯片的出现为解决这些难题提供了新的思路。本实验利用基因芯片技术对BMSCs分化过程中的基因表达谱进行分析。通过分析，我们发现在0d和7d的芯片表达谱中共有差异基因97条，其中上调基因62条，下调基因35条。这些基因中有24条基因功能相对单一且与神经元发育密切相关。我们挑选了部分重要的差异表达基因，现将这些基因的最新研究以及它们与神经元的关系进行简单的阐述。

Noggin基因在胚胎发育和神经系统的成熟过程中起到重要作用，其神经诱导功能主要与其对骨形态形成蛋白(BMP)的抑制作用有关［4］。Noggin与BMP2/BMP4的亲和性较高，可阻滞BMP2/BMP4与其相应的受体结合，抑制BMPs受体信号通路，从而诱导神经细胞的形成。小鼠胚胎干细胞的诱导分化实验证实，Noggin与BMP4可调控胚胎干细胞向神经元的分化，还可调控成年神经干细胞的增殖与分化，抑制Noggin基因转录可降低神经干细胞的增殖［5］。Noggin参与调节成年神经干细胞向神经胶质细胞形成和神经元形成之间的平衡，调节学习和记忆的过程。这都表明Noggin具有重要的神经诱导功能。我们实验中Noggin在BMSCs诱导分化后高表达进一步证实了其在BMSCs向神经元分化过程中扮演着很重要的角色。BMP4(bone morphogenetic protein 4，骨形态形成蛋白)在神经系统发育的不同时期、不同部位均起着重要的作用。其在启动BMSCs分化过程中发挥重要作用，主要表达于神经前体细胞，对神经前体细胞具有诱导其增殖和分化的作用。有报道表明在干细胞分化过程中，BMP4即可以促进神经元的分化，也可以促进神经胶质细胞的分化，其在胚胎发育第13d天时促进神经元的分化，在17d时促进胶质细胞的分化［6］。在神经元分化的中后期，其促进胶质细胞分化的功能受到Noggin基因抑制，从而促进了BMSCs向神经元方向分化。Rtn1基因是浆膜蛋白家族的成员，在具有神经内分泌性质的细胞中高度表达，因此被称为神经内分泌特异蛋白(neuroendocrine specific protein，NSP)［7］。其已被证实与神经系统内分泌密切相关，其编码的蛋白质-浆膜蛋白对神经元的增殖和分化起到重要的作用。MAP2(microtubule-associatedprotein 2，微管相关蛋白2)是神经元特异性微管相关蛋白，有稳定神经元微管和保持神经元形态的作用，是突起胞浆的重要组成部分，位于神经元的胞体和树突，其对BMSCs诱导后细胞形态的改变及保持神经元的功能起到重要作用。此外，MAP2是树突中主要的PKA(cAMP-dependent protein kinase)锚定蛋白，MAP2缺失，引起大脑皮层及海马神经细胞树突中PKA量减少，由于PKA量的减少，PKA底物之一CREB(cAMP-responsive element binding protein)的磷酸化发生异常，从而导致神经细胞信号转导出现异常。因此，MAP2除了有稳定神经元微管和保持神经元形态的作用外，在调节PKA的量、控制诱导CREB的磷酸化，即神经细胞信号转导方面也起着重要的作用。Numb基因主要分布在分裂中的神经上皮中的顶部皮层，在神经上皮皮层垂直分裂的时候，Numb基因起抑制分化的作用并维持神经上皮状态［8］，另有研究表明Numb基因为参与神经干细胞定向分化过程的基因之一［9］。本实验中Numb基因在BMSCs向神经元样细胞分化后表达下降，这与该基因的分子生物学特性相符合，BMSCs未分化前大部分细胞维持干细胞状态，Numb基因高表达，BMSCs经诱导后向成体神经元样细胞转化，Numb基因的表达量有所下降。

综上所述，本实验通过对BMSCs诱导分化前后基因表达谱的分析，发现了部分与神经元分化相关的差异表达基因，一方面进一步支持了BMSCs可以向神经元方向转化的理论;另一方面深化了对BMSCs向神经元分化相关分子机制的理解。在后续的实验中我们将行RT-PCR及Western Blot对筛选出的差异表达基因进行进一步的验证及研究，以便我们通过人工干预的手段促使其更好的向神经元方向分化，为基因工程改造利用BMSCs奠定扎实的基础。

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