石冬琴，王荣*，谢华，田薇，贾正平*，郭建魁

(1.全军高原损伤防治重点实验室，兰州军区兰州总医院临床药理基地，甘肃兰州 730050;2.浙江农林大学林业与生物技术学院，浙江临安 311300)

K-ras 基因是ras 基因家族中3种癌基因的一种，为表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)信号传导通路的下游基因，与结直肠癌关系密切［1］。我国大肠癌发病率已占到常见肿瘤的第四位，且发病率已达5%，高于2%的国际水平;每年新发病例约40万，其中30～40岁的中年人居多。各个国家和地区的结直肠癌中K-ras 基因突变率并不相同，欧美为30%～68%［2，3］，而中国为14%～43.8%［4，5］。K-ras 基因最常见的激活方式是点突变，其中90%发生在第一外显子的第12、13位密码子上，其中70%发生于第12位密码子，30%发生于第13位密码子［6］;极少文献报道第19、61、63位密码子发生突变。第12、13位密码子常用的检测方法主要有DNA 测序［7］。根据结直肠癌患者中Kras 基因是野生型还是突变型，将传统意义上的一种疾病分成两种独立的疾病进行治疗。结直肠癌患者中K-ras 基因为突变型的约占40%，而其余60%左右的K-ras 基因为野生型，目前临床治疗中抗EGFR靶向药物对K-ras 野生型大肠癌患者疗效显著，而对突变型无效，如不加区分采取同一种药物治疗将会增加不良反应风险和治疗费用。因此，对K-ras突变类型的检测［7-13］，可以筛选出抗EGFR 靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而达到良好的预后，延长患者生存期。临床统计分析发现，大肠原发病灶的患者手术后5年复发转移率较高，即病情分期越晚者复发转移的风险越高。早期检测K-ras 基因，可早期治疗，从而有效降低病人复发转移的风险。因此，检测K-ras 基因第12/13位密码子的突变情况，对于结直肠癌的临床早期诊断、治疗和预后有重要意义。

本实验采用毛细管电泳-激光诱导荧光检测(CE-LIF)结合单链构象多态性(SSCP)技术，采用作者所在课题组已建立的CE-SSCP 方法检测了临床结直肠癌手术标本和经福尔马林固定石蜡包埋(FFPE，formalin-fixed and paraffin-embedded)同一组织标本中K-ras 基因第12/13位密码子突变，并应用DNA 直接测序法进行验证，其结果可为结直肠癌的临床诊断和治疗提供科学理论依据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

P/ACE System5000型毛细管电泳仪、P/ACE System5000 station 数据处理软件、P/ACE System laser module 488 nm 激光检测器(美国Beckman 公司);石英毛细管柱(河北永年光导纤维厂);DYY-8C 型电泳仪、DYCZ-24E 型电泳槽(北京市六一仪器厂);AE240型电子天平(瑞士Mettler 公司);高速离心机(德国Heraeus 公司);PCR 扩增仪(杭州晶格科学仪器有限公司)。

聚环氧乙烷(PEO，Mr=300000)、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS)、丙烯酰胺(国药集团化学试剂有限公司)，γ-甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷(MAPS)(Johson Matthey 公司)，三羟甲基氨基甲烷(Tris，上海山浦化工有限公司)，硼酸、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(天津化学试剂厂)，SanPrep柱式PCR 产物回收试剂盒SK8142、Taq DNA 聚合酶、PCR 试剂、DNA Marker-B GM331、6× Loading Dye Solution SD8314、pUC19 DNA/Msp I(Hpa II)Marker(上海生工生物工程技术服务有限公司)，Golden View 核酸染料、核酸染料SYBR Green Ⅰ(10000×，50μL/支;厦门百维信公司)，以上试剂均为分析纯。

0.5× Tris-硼酸(TBE)缓冲液成分:0.045 mol/L Tris-硼酸+0.001 mol/L EDTA;1×Tris-乙酸(TAE)缓冲液成分:0.04 mol/L Tris-乙酸+0.001 mol/L EDTA。

样品测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

结直肠癌及癌旁正常组织样本(包括临床手术后组织和经FFPE 处理的同一组织)共76例152个样本，其中男53例，女23例，年龄20～84岁，平均年龄(65±2)岁。所有标本取自兰州军区兰州总医院病理科，结直肠部切除组织并经病理切片证实，其中高分化腺瘤6例，中分化腺瘤46例，低分化腺瘤13例，黏液腺瘤11例。

1.2 实验步骤

1.2.1 DNA 提取

结直肠癌及癌旁正常组织的DNA 提取:用扭力天平称取结直肠癌及癌旁正常组织40 mg，剪碎匀浆后加入蛋白酶-K 消化，采用传统的酚-氯仿法提取基因组DNA。采用紫外分光光度计对提取的基因组DNA的纯度和浓度进行检测，在260、280 nm波长下的光密度D的比值(D260/D280)为1.7～1.9，符合DNA 检测要求。于-20℃下保存待用。

FFPE 组织标本的DNA 提取:用电子天平称取石蜡切片20～25 mg，放入2 mL的无菌离心管中。首先对其进行脱蜡:加入1 mL的二甲苯充分摇匀，于3000×g 下离心2 min，弃去上清液;加入1 mL无水乙醇混匀，于3000×g 下离心2 min，弃去上清液，再重复脱蜡一次;然后依次用100%、95%和75%的乙醇各1 mL 洗至沉淀为松散的白色。脱蜡完全后的组织由原来的粉红透明状变为松散的白色沉淀状。然后对其进行消化:将脱蜡后的组织放入37℃温箱中15～30 min，待乙醇挥发干净后，加入200μL的STE 溶液(100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，20 mmol/L EDTA，8 g/L SDS)，于90℃水浴锅中加热10 min 后，加入20 g/L 蛋白酶-K，在55℃水浴中加热3 h 以上直至絮状物消失。于3000×g下离心1 min，取上清液，采用传统的酚-氯仿法提取基因组DNA，D260/D280值为1.7～1.9，于-20℃下保存待用。

1.2.2 K-ras 基因的PCR 扩增及纯化

所选引物为文献［14］中所述的K-ras 基因第一外显子第12/13位密码子所需特异性引物，上游引物:5'-AGGCCTGCTGAAATGACTGAATA-3，下游引物:5'-CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3。扩增产物长度约184 bp。PCR 反应体系为25μL，其中含dNTP 200μmol/L、引物0.05μmol/L、Taq 聚合酶5 U/μL、模板DNA 0.5μg。PCR 反应循环条件:94℃变性30 s，59.6℃退火30 s，72℃延伸30 s，共行30个循环。由于扩增过程中产生的引物二聚体以及dNTP、引物、镁离子等会影响分析结果，本实验采用SanPrep 柱式PCR 产物回收试剂盒纯化PCR扩增产物。

1.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测

取纯化后PCR 扩增产物5μL，加入1μL 6×蛋白上样染料溶液(Loading Dye Solution)进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳缓冲液为1×TAE 缓冲液(pH 8.5)，用Golden View 核酸染料染色，并用凝胶成像分析系统照相和分析结果。

1.2.4 CE-SSCP 检测

根据文献［15］的方法涂层毛细管柱(37 cm ×75μm，有效长度27 cm)。取5μL PCR 产物加入纯水20μL，95℃变性15 min，立即在冰浴中放置5 min，于3000×g 下离心10 s。向25μL 经变性处理的样品中加入5μL SYBR GreenⅠ并混合均匀，在10 kV电压下负极电动进样15 s，采用课题组已建立的以3% PEO 为筛分介质分离pUC19 DNA/Msp I(Hpa II)Marker的最佳分离条件，对结直肠癌临床手术直接取用组织和FFPE 组织标本中的K-ras 基因的第12/13位密码子的突变情况进行检测。

1.2.5 DNA 测序分析

用ABI-PRISM 3730测序仪测序验证经CE-SSCP 检测的样品。

2 结果与讨论

2.1 pUC19 DNA/Msp I(Hpa II)Marker 最佳分离条件

采用课题组已建立的CE 分离pUC19 DNA/Msp I(Hpa II)Marker的最佳条件［15］:筛分介质PEO的含量为3%、缓冲液TBE的pH 8.3、电压15 kV、温度15℃。CE 分离结果如图1所示:共得到11个峰，基本达到基线分离，15 min 内达到完全分离。表明建立的方法具有分离快速、分离度良好的优点。

2.2 琼脂糖凝胶电泳结果

2%琼脂糖凝胶电泳分析纯化的扩增产物，结直肠癌组织及癌旁正常组织的电泳扩增结果见图2。如图2可见，扩增获得了纯度较高的目的产物。

图1 毛细管电泳分离pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)Marker Fig.1 Electropherogram of pUC19 DNA/MspⅠ(Hpa Ⅱ)Marker separation by CE

图2 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物的谱图Fig.2 Electropherogram of PCR amplification by AGE

2.3 CE-SSCP 结果

SSCP 分析的原理是基于单链DNA 具有不同的构象，DNA 链上单个碱基的变化会引起其构象的变化，构象不同则电泳淌度随之改变，通过电泳将构象上有差异的单链分离。临床手术所取样品按照1.2.4节的条件处理，获得变性样品，经CE-LIF 检测分析，结果见图3。图3a 为结直肠癌旁正常组织扩增变性样品，图3b 为结直肠癌组织扩增变性样品。比较上述两图，发现结直肠癌组织中除有正常样品的野生型单链DNA 外，还存在有异常单链DNA，即结直肠癌K-ras 基因第12/13位密码子突变样本中除具有野生型DNA 变性后会有的两个单链DNA 外，还存在突变基因变性后的两条单链DNA。因此，可通过癌旁正常组织(图3a)的电泳谱图(作为野生型标准对照谱图)判读癌组织突变型(图3b)的K-ras 基因第12/13位密码子的突变是否发生。

FFPE 组织标本和临床手术直接取用组织样品的检测结果一致。

通过CE-LIF 检测各类组织样品，证实所建立的方法可有效地检测结直肠癌K-ras 基因第12/13位密码子的突变。

图3 CE-SSCP 检测变性(a)结直肠癌旁正常组织和(b)结直肠癌组织的DNA 电泳图Fig.3 Electropherograms of degenerated DNA samples of(a)normal tissue and(b)colorectal cancer tissue by CE-SSCP

2.4 测序结果

为进一步确认CE-LIF 检测的样本发生突变的类型，对相应样本进行了测序分析。测序结果显示，K-ras 基因突变为单个碱基点突变，即K-ras 基因第12位密码子主要突变类型有GGT→GAT、GGT→GCT和GGT→CGT;第13位密码子主要突变为GGC→GAC，其中以碱基G 替换为碱基A(G→A)的点突变为主。

2.5 临床样本K-ras 基因突变结果

分别对76例患者临床手术切除组织获得的癌组织及癌旁组织共计152个样本进行K-ras 突变基因第12、13位密码子检测，经CE-LIF 检测和基因测序，表明CE-SSCP 检测和基因测序结果一致，K-ras基因第12、13位密码子突变类型见表1。

表1 76例患者中K-ras 基因第12、13位密码子突变类型的CE-LIF 检测和基因测序结果Table 1 Results of codons 12 and 13 mutation type of K-ras in the 76 cases by CE-LIF and gene sequencing

3 结论

采用课题组已建立的方法［15］检测了76例结直肠癌患者组织中K-ras 基因第12/13位密码子突变情况，结果显示30例发生突变，突变率为39.5%(30/76)，该结果与文献报道中国的结果(14%～43.8%)［4，5］一致。结直肠癌患者中K-ras 基因的高突变率，表明K-ras 基因突变在结直肠癌的发生及发展中有重要作用。基因突变常以碱基的缺失、插入、替代为主，从而引起癌基因的激活与抑癌基因的失活。本研究通过直接测序证实，K-ras 基因碱基发生点突变，以碱基G 替换为碱基A 为主要突变类型，其中第12位密码子GGT 突变为GAT的突变率为28.9%(22/76)，第13位密码子GGC 突变为GAC的突变率为5.3%(4/76)。与以往文献报道的中国人K-ras 基因突变以第12位密码子(GGT→GAT)多见［4］的结果一致。

尽管已有文献［16］报道采用CE 方法对K-ras 基因进行了检测，但本研究结果证实，作者所在课题组所建立的以3%PEO 为筛分介质的CE-SSCP 分析方法可以在11 min 内分离pUC19 DNA/Msp I(Hpa II)Marker 11个DNA 片段及4个单链DNA(ssDNA)，较文献报道的以6%线性聚丙烯酰胺为筛分介质的CE 方法分离时间短，且多次检测证实分析条件稳定。

近年来，靶向药物的出现为结直肠癌的治疗带来了希望，但治疗效果与K-ras 基因突变与否有密切的关系，因此K-ras 基因突变与抗结直肠癌治疗效果的相关性受到人们的重视，K-ras 基因突变的检测在治疗及预后方面有重要意义。同时，K-ras 基因突变的检测有助于实现肿瘤治疗的个体化，不仅可以提高药物疗效，减轻患者病痛，而且能够减少患者经济负担和医疗支出。此外，CE-SSCP 法与直接基因测序法相比，具有操作简单、运行成本低、不需要设计检测探针的优点，可用于临床批量检测。

［1］Ciardiello F，Tortora G.N Engl J Med，2008，358:1160

［2］Halatsch M E，Hirsch-Ernst K I，Weinel R J，et al.Anticancer Res，1998，18:2323

［3］Doolittle B R，Emanuel J，Tuttle C，et al.Exp Mol Pathol，2001，70(3):289

［4］Yuan P，Sun M H，Zhang J S，et al.Chinese Journal of Clinical and Experimental Pathology(袁平，孙孟红，张锦生，等.临床与实验病理学杂志)，2000，16(6):464

［5］Tang W Z，Gao F，Li W，et al.Tumor(唐卫中，高枫，李卫，等.肿瘤)，2006，26(3):282

［6］Frattini M，Saletti P，Romagnani E，et al.Brit J Cancer，2007，97(8):1139

［7］Patil D T，Fraser C R，Plesec T P.Curr Oncol Rep，2010，12:160

［8］Khamvata-Ford S，Garrett C R，Meropol N J，et al.J Clin Oncol，2007，25(22):3230

［9］Jonker D J，O'Callaghan C J，Karapetis C S，et al.N Engl J Med，2007，357(20):2040

［10］Qiu L X，Mao C，Zhang J，et al.Euro J Cancer，2010，46(15):2781

［11］Ciardiello F，Tortora G.N Engl J Med，2008，358:1160

［12］Sameer A S，Chowdhri N A，Abdullah S，et al.Indian J Cancer，2009，46:219

［13］Yen L C，Uen Y H，Wu D C，et al.Ann Surg，2010，251:254

［14］Jhawer M，Gosl S，Wilson A J，et al.Cancer Res，2008，68(6):1953

［15］Liu Y Y，Wang R，Jia Z P，et al.Acta Chimica Sinica(刘圆圆，王荣，贾正平，等.化学学报)，2009，67(4):323

［16］Shi X Z，Li J H，Zhao C X，et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry(石先哲，李建华，赵春霞，等.分析化学)，2005，33(2):177