张新欣，魏冬婷，柯琼华，程 超*

（湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000）

茶仅次于水，以它为主体加工的产品在全球市场占据着不可取代的地位。茶多酚（tea polyphenols，TP）是一种从茶叶中提取的天然复合物，茶叶中的质量分数约15%～30%[1]。富含多酚类物质的茶叶具有明显的抗氧化、抗菌消炎效果[2-3]。

前人研究发现膳食因素均会影响到茶的抗氧化特性，ALEXANDROPOULOU I等[4]发现在体外模拟胃肠液中，铁离子、肉类和酪蛋白会降低绿茶的抗氧化能力，而VC可使绿茶的抗氧化性能增强。SHARMA V等[5]研究了纯红茶、红茶加糖、红茶加牛奶、红茶加牛奶和糖的抗氧化和自由基清除作用，发现对自由基清除能力强弱为纯红茶＞红茶加糖＞红茶加牛奶和糖＞红茶加牛奶。RYAN L等[6]发现全脂牛奶、半脱脂牛奶、脱脂牛奶会降低茶汤的抗氧化能力，脱脂牛奶对其抗氧化能力的降低程度显著强于全脂牛奶和半脱脂牛奶。STASZEWSKI MV等[7]发现乳清蛋白会降低绿茶对1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除作用和抑菌能力。DUBEAU S等[8]用2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）、伏安法、脂质过氧化的方法评价牛奶对绿茶、大吉茶和英式早餐茶的抗氧化能力的影响，结果发现用ABTS方法，牛奶降低3种茶的抗氧化的能力，但不同茶叶降低程度不同；伏安法的降低程度是ABTS方法的4倍，而脂质过氧化中，牛奶可提高3种茶抗氧化能力，因此牛奶对茶的抗氧化能力具有双重作用。因此本研究主要在前人研究基础上，考虑到日常饮食中的主要营养素如蛋白质（全脂牛奶、脱脂牛奶）、甜味剂（蔗糖、阿斯巴甜）等对茶多酚抗氧化作用的影响，采用活性氧体系和基于电子转移的两种体系研究上述膳食因素对茶多酚抗氧化特性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿茶：恩施炒青绿茶。

脱脂牛奶：完达山脱脂奶粉（蛋白质34%，碳水化合物53.2%，脂肪1.30%）。

全脂牛奶：伊利全脂甜奶粉（蛋白质19%，碳水化合物52.8%，脂肪23.1%）。

蔗糖；乙酸；乙酸钠；硫酸亚铁；三羟甲基氨基甲烷；双氧水；过硫酸钾；无水乙醇等试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；阿斯巴甜购于上海浦帮食品添加剂有限公司；ABTS购于美国TCI公司；邻二氮菲购于沈阳市试剂厂。

1.2 仪器与设备

756MC紫外可见分光光度计：上海精研电子科技有限公司；RE-2000B旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；ALPHA1-2真空冷冻干燥设备：德国M.CHRIST；GZX-9140 MBE型电热鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DL-5低速大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；SHZ-82A数显水浴恒温振荡器：金坛市科兴仪器厂；SG-4050C恒温水浴锅：上海苏豪智能系统有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶多酚的提取工艺流程[9]

取100g炒青绿茶，粉碎，按料液比1∶10加入70%vol乙醇70℃回流提取1h，4000r/min离心15min后取沉淀二次提取，合并两次上清液，旋蒸浓缩，真空冷冻干燥，得粗茶多酚粉末，备用。

1.3.2 抗氧化性能的测定

（1）茶多酚对ABTS自由基的抑制能力[10-11]

将5mL的7mmol/L ABTS和88μmol的140mmol/L过硫酸钾混合，在室温避光的条件下静置12h～16h，形成ABTS自由基贮备液。再将ABTS储备液用10mmol/L pH值为7.4磷酸缓冲液稀释，使其在734nm波长条件下的吸光度为0.70±0.02，待用。

配制0.20mg/mL、0.40mg/mL、0.60mg/mL、0.80mg/mL、1.0mg/mL茶多酚溶液，取1mL配置好的ABTS测试液加入3μL样品溶液振摇30s，反应6min后在734nm波长条件下测定其吸光度A样。重复3次，取其平均值。ABTS自由基清除率计算公式：

（2）茶多酚对羟基自由基的清除作用

利用Fenton体系产生·OH[12-15]：首先配制0.20mg/mL、0.40mg/mL、0.60mg/mL、0.80mg/mL、1.0mg/mL茶多酚溶液。

取1mL 0.75mmol/L邻二氮菲溶液于试管中，加入2.0mL pH值为7.4的0.20mol/L的磷酸缓冲液，混匀后加0.75mmol/L硫酸亚铁溶液1.0mL和0.010%的双氧水1mL，37℃水浴1h后，在波长536nm条件下测定吸光度A536nm，此为损伤管的吸光度（A损伤）。未损伤管（A空白）以1mL蒸馏水代替损伤管中双氧水，操作方法同损伤管。样品管（A样品）以0.20mL样品溶液代替损伤管中的蒸馏水，操作方法同损伤管。重复3次取平均值。羟基自由基清除率计算公式：

（3）样品溶液的配制

依据人类摄入蛋白（全脂奶粉、脱脂奶粉）、甜味剂（蔗糖、阿巴斯甜）等的参考量来设置其质量浓度梯度，分别配制蛋白质质量浓度梯度为70mg/mL、50mg/mL、30mg/mL、10mg/mL，甜味剂质量浓度梯度为10.0%、8.0%、6.0%、4.0%、2.0%。以茶多酚溶液/膳食因素溶液为1∶1的比例进行混合，考察混合后茶多酚的抗氧化特性的变化。

2 结果与分析

2.1 膳食因素对茶多酚清除ABTS自由基能力的影响

2.1.1 茶多酚对ABTS自由基的抑制作用

由图1可知，在一定的浓度范围内，一定质量浓度茶多酚溶液对ABTS自由基抑制作用随着含量增加而逐渐增大，二者线性相关，线性回归方程为y=61.229x+0.0824，相关系数为R2=0.9909。通过回归方程可计算出茶多酚对ABTS的IC50为0.82mg/mL。在与膳食因素混合时则采用此浓度。

图1 茶多酚对ABTS自由基的清除能力Fig.1 The elimination rate of TP on ABTS

2.1.2 膳食因素对茶多酚清除ABTS作用的影响

图2、图3分别表明奶粉和甜味剂与茶多酚混合前、后抗氧化性能的变化。由图2可知，脱脂奶粉+茶多酚的对ABTS的抗氧化效果要优于全脂奶粉+茶多酚，但二者均会使茶多酚的抗氧化效果下降，并且具有明显的剂量效应关系，最高质量浓度的脱脂奶粉可使茶多酚对ABTS的清除率下降53.00%，全脂奶粉则可使其下降63.05%，其主要原因可能是因为牛奶中的蛋白质和碳水化合物与茶多酚相互作用导致茶多酚抗氧化效果下降[4]，但是脱脂奶粉的抑制效果弱于全脂奶粉的可能是因为在奶粉配方中添加的有VA等物质。本实验结果与RYAN L等[6]的研究结果不同，可能与室验茶叶种类有关，实验材料选用的是红茶，本实验为绿茶材料。

由图3可知，蔗糖和阿斯巴甜均可降低茶多酚的抗氧化效果，低浓度时二者的影响效果相当，但随着甜味物质的质量浓度增加，蔗糖对茶多酚抗氧化的降低程度略大于阿斯巴甜，实验中高质量浓度蔗糖和阿斯巴甜对茶多酚抗氧化的降低效果分别为58.59%和53.82%。

图2 奶粉对茶多酚清除ABTS自由基的影响Fig.2 Effect of milk powder on the elimination effect of TP on ABTS

图3 甜味剂对茶多酚清除ABTS自由基的影响Fig.3 Effect of sweeter on the elimination effect of TP on ABTS

2.2 对羟自由基的清除作用

2.2.1 茶多酚对羟自由基的清除作用

图4 邻二氮菲体系中茶多酚对·OH的清除作用Fig.4 Elimination effect on·OH of TP in the 1,10-phenanthroline monohydrate system

由图4可知，在一定的浓度范围内，一定质量浓度茶多酚溶液对羟基自由基清除作用随着含量增加而逐渐增大，二者线性相关，线性回归方程为y=35.946x-1.1695，相关系数为R2=0.9912。茶多酚对·OH的IC50为1.49mg/mL，在与膳食因素混合时则采用此浓度。

2.2.2 膳食因素对茶多酚清除羟自由基能力的的影响

图5、图6表明奶粉、甜味剂与茶多酚混合前、后的抗氧化性能的变化。

图5 奶粉对茶多酚清除·OH的影响Fig.5 Effect of milk powder on the elimination effect of TP on·OH

由图5可知，全脂奶粉+茶多酚对·OH的抗氧化效果要优于脱脂奶粉+茶多酚，二者均会使茶多酚的抗氧化效果下降，且具有明显的剂量效应关系。实验设计的最高质量浓度脱脂奶粉和全脂奶粉使茶多酚对·OH的抑制效果分别下降36.39%和24.17%。

图6 甜味物质对茶多酚清除·OH的影响Fig.6 Effect of sweeter on the elimination effect of TP on·OH

由图6可知，甜味物质同样会降低茶多酚的抗氧化特性，但蔗糖与阿斯巴甜的效果相当，阿斯巴甜的影响略大于蔗糖的，阿斯巴甜10%和蔗糖10%对茶多酚抗氧化的抑制作用分别下降30.07%和30.77%。

3 结论

3.1 实验表明，本实验所涉及的几种膳食因素均会使茶多酚的抗氧化性能下降，对ABTS自由基而言，影响的强弱顺序为全脂奶粉＞蔗糖＞阿斯巴甜＞脱脂奶粉；对·OH影响强弱的顺序为脱脂奶粉＞阿斯巴甜＞蔗糖＞全脂奶粉。因此针对不同的自由基，膳食因素使茶多酚抗氧化性能的下降程度不同。可能是因为ABTS自由基和OH自由基本身的稳定性不同，因此各种膳食因素对二者的影响也就不同。

3.2 蔗糖使茶多酚对ABTS自由基和·OH的抑制作用的下降效果相当，这可能是因为碳水化合物可以与茶多酚相互作用，从而封闭茶多酚发挥抗氧化作用的基团[4]，经统计分析差异不显著。阿斯巴甜+茶多酚对·OH的抑制作用显著弱于阿斯巴甜+茶多酚对ABTS清除作用，·OH的反应原理是基于活性氧自由基，而ABTS是基于电子转移的，由此可见阿斯巴甜这种二肽甜味剂会影响到茶多酚的发挥抗氧化活性的结构基团，但此结论尚需进一步验证。

3.3 在不同抗氧化体系中，全脂奶粉和脱脂奶粉对茶多酚的抗氧化效果影响差异很大，在ABTS体系中，全脂奶粉的抑制效果强于脱脂奶粉；而·OH正好相反。这可能与奶粉中所含的复杂的化学成分有关，实验选用的奶粉为超市购买，由于脂肪种类含量不同，导致其中脂溶性成分等也不同；同时奶粉配方不同致使其中的VC和VA等类物质含量也有差异，因此在不同体系中出现了不同的影响效果。奶粉中添加的这些物质对茶多酚抗氧化效果的影响还有待于进一步研究。

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