董树国，陆 钊

（吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013）

桑叶为桑科植物的干燥叶子，具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功能。桑叶中含有氨基酸、维生素、多糖、生物碱和黄酮等多种生物活性成分，具有降血压、降血脂、降血糖、抗炎、抗衰老等功效。黄酮是桑叶的重要的活性成分[1-3]，具有多种生物活性。桑叶黄酮的提取方法主要有有机溶剂提取[4]、微波辅助提取[5]和超声波辅助提取[6]。酶解提取是利用酶的高活性和高选择性，在适宜的条件下，较温和地分解植物组织，提高提取效率的方法，已广泛用于中药活性成分提取[7-11]。表面活性剂协同提取是利用表面活性剂降低表面张力，增强溶剂对物料的润湿性和渗透性，对天然产物的有效成分具有增溶作用，从而增加浸出效能和萃取率，已在天然产物提取中得到较多的应用[12-15]。本实验利用纤维素酶对桑叶进行酶解，以表面活性剂的水溶液为提取剂，利用超声波辅助提取桑叶中的总黄酮，并对提取工艺条件进行优化，为进一步研究高效、低成本的桑叶总黄酮的提取分离工艺提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑叶购于吉林大药房；Tween-80、纤维素酶、芦丁标准品（纯度＞98%）购于国药集团上海试剂公司；甲醇、乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠均为国产分析纯，实验用水为蒸馏水

1.2 仪器与设备

T6-新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；KQ-250E超声波清洗仪：昆山市超声波仪器有限公司；FA1104型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；HH-4恒温水浴锅：金坛市环宇科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 样品溶液的制备

取过40目筛的桑叶粉末4.0g置于锥形瓶中，加入40mg纤维素酶（按桑叶质量的1.0%加入），适宜pH值的缓冲溶液40mL，在一定温度条件下酶解2h后，加入不同质量浓度的Tween-80 溶液120mL，超声（250W、40kHz）提取一段时间后，过滤，滤液移入250mL容量瓶，以蒸馏水稀释至刻度，得到样品溶液，备用。

1.3.2 标准曲线的绘制及样品总黄酮的测定

准确称取芦丁标准品50mg于烧杯中，以少量甲醇溶解，移入25mL容量瓶中，以甲醇稀释至刻度，得质量浓度为2mg/mL的芦丁标准溶液。

精密量取芦丁标准溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL，分别置于10mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，放置6min后，加入10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀放置6min，加4%氢氧化钠溶液4mL，以30%vol乙醇溶液定容至10mL，摇匀放置15min，以相应的试剂为空白，在波长510nm处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，拟合出回归方程为Y=0.0386+0.00612X，r=0.9994，结果表明，芦丁质量浓度为20μg/mL～100μg/mL时，芦丁质量浓度与吸光度值之间具有良好的线性关系。

准确移取样品溶液2mL，按照上述的实验方法测定吸光度值，根据标准曲线方程计算相应的总黄酮浓度。

1.3.3 总黄酮提取率的计算

根据测定的样品中总黄酮含量，计算提取液中总黄酮的含量，总黄酮的提取率的计算公式：

1.3.4 单因素试验

以总黄酮提取率为考察指标，分别对酶解温度、pH值、Tween-80质量浓度，提取时间进行单因素试验。

1.3.5 正交试验在单因素试验的基础上，进行提取条件优化正交试验，确定最佳提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 酶解温度对总黄酮提取率的影响

取4.0g桑叶，加入1.0%纤维素酶，缓冲溶液（pH5.5）40mL，分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃进行酶解2h，加入质量浓度为1.00%的Tween-80溶液120mL，超声波（250W、40kHz）提取40min，按实验方法1.3.2测定总黄酮的含量，并计算总黄酮的提取率，结果见图1。由图1可知，当温度为50℃时，总黄酮的提取率最大，温度低影响酶的活性，温度过高可能导致酶失活，影响催化效果。

2.2 酶解pH值对总黄酮提取率的影响

取桑叶4.0g，加入1.0%纤维素酶，分别加入pH值为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的缓冲溶液40mL，于50℃酶解2h，加入质量浓度为1.00%的Tween-80溶液120mL，超声波（250W、40kHz）提取40min，按实验方法1.3.3测定提取液中总黄酮含量并计算总黄酮提取率，结果见图2。由图2可知，在pH值为6.0时总黄酮提取率最大。

图2 pH值对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of pH value on extraction rate of total flavonoids

2.3 Tween-80质量浓度对总黄酮提取率的影响

取桑叶粉末4.0g，加入1.0%纤维素酶，缓冲溶液(pH6.0)40mL，50℃酶解2h，加入质量浓度分别为0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%的Tween-80溶液120mL，超声波（250W、40kHz）提取40min，按实验步骤1.3.3，测定总黄酮含量，并计算总黄酮提取率，结果见图3。由图3可知，随着Tween-80质量浓度的增加，总黄酮提取率增加，在Tween-80质量浓度为1.00%时，总黄酮提取率最大，而后总黄酮提取率下降。

图3 Tween-80质量浓度对提取率的影响Fig.3 Effect of Tween-80 concentraction on extraction rate of total flavonoids

2.4 提取时间对总黄酮提取率的影响

称取桑叶粉末4.0g，加入1.0%纤维素酶，缓冲溶液（pH6.0）40mL，50℃酶解2h，加入质量浓度1.00%的Tween-80溶液120mL，超声波（250W、40kHz）提取10min、20min、30min、40min、50min，按方法1.3.3测定吸光度值，计算总黄酮提取率，结果见图4。由图4可知，随着提取时间的增加，总黄酮提取率增加，但40min后总黄酮提取率增加缓慢。

2.5 提取工艺优化正交试验

根据单因素试验结果，选取酶解温度、pH值、Tween-80质量浓度、超声提取时间为主要影响因素，进行L9（34）正交试验，以桑叶总黄酮提取率为考察指标，对4个影响因素进行优化。正交试验因素水平见表1，正交试验结果见表2，方差分析见表3。

图4 提取时间对总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids

表1 提取工艺条件优化正交试验的因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for process opimization

表2 提取工艺条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for process optimization

表3 提取工艺条件正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment result

由极差分析结果（表2）可知，试验中各因素的影响次序为C（Tween-80质量浓度）＞D（提取时间）＞A（酶解温度）＞B（pH值），其最佳工艺组合为A2B3C2D3，即酶解温度50℃，pH值为6.5，Tween-80质量浓度为1.00%，超声提取时间50min。由表3的方差分析可知，因素C（Tween-80质量浓度）对总黄酮提取率影响较为显著。

在优化工艺条件下，对3份桑叶进行总黄酮提取，其总黄酮提取率分别为1.34%、1.29%、1.27%，总黄酮平均提取率为1.30%，未用纤维素酶对桑叶进行酶解时，桑叶总黄酮提取率1.03%，表明酶解可破坏桑叶细胞壁，从而提高总黄酮提取率。酶解-超声波-表面活性剂提取总黄酮的优化工艺稳定，能够提高总黄酮提取率。

3 结论

利用纤维素酶对桑叶进行酶解，破坏桑叶细胞壁，以低质量浓度Tween-80水溶液为提取剂，超声波协同提取桑叶总黄酮能够增加黄酮的溶解提高提取率。本实验研究了酶解温度、pH值、Tween-80质量浓度、超声提取时间对桑叶总黄酮提取率的影响，利用正交试验对酶解-超声波-表面活性剂协同提取桑叶总黄酮的工艺条件进行优化，确定的最佳提取工艺条件为酶解温度50℃，pH值6.5，Tween-80质量浓度1.00%，提取时间50min。在最佳提取工艺条件下，桑叶总黄酮的提取率为1.30%。

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