周防震，谢园园，赵 婷，田梦洋

（湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施 445000）

硒是人体必需的微量元素之一，具有维护心脏生理功能、增加免疫能力[1]、对抗异常细胞和致突变作用、对抗生物体内有毒重金属[2]、抗氧化[3]、抗癌、排毒解毒、保肝护肝[4]等作用。同时，硒对白内障、心血管疾病、克山病、大骨节病、关节炎等疾病[5-6]也有一定的防治作用。但过量摄入硒会产生中毒症状[7]，故对硒的补充利用需慎重。

研究表明，无机硒毒性强、吸收低而有机硒则较为安全[8]。目前有机硒的获得运用较多的是培养富硒酵母[9]。富硒益生菌是一种借助益生菌将无机硒转变成有机硒，具有有机硒和益生菌双重作用[10]。实验以富硒矿床土壤为样品，从富硒微生物的筛选、鉴定及富硒条件优化方面展开研究，以期筛选一株天然富硒微生物，为利用微生物富集合成有机硒提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土壤样本采集于湖北恩施双河乡渔塘坝富硒矿床，获得的菌种现保存于湖北民族学院微生物实验室。Na2SeO3购于美国invitrogen公司，Tris、十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、溴乙啶染液、蛋白酶K、琼脂糖、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、饱和酚、氯仿、异戊醇购于日本TAKARA公司，其他试剂购于国药集团，引物合成由美国invitrogen公司完成。

1.2 仪器与设备

SHZ-2AS恒温振荡器：江苏金坛环宇科学仪器厂；DL-5-B低速大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；SPX-250B-D型振荡培养箱：苏州江东精密仪器有限公司；BL-50G型立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-2F型双人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司；DYY-10C型电泳仪：北京市六一仪器厂；Applied Biosystems 2720 Thermal cycler PCR仪：美国ABI公司；ChemiDoc XRS凝胶成像仪：美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 耐硒微生物的筛选

在恩施双河乡渔塘坝硒矿床采集土壤样本，用无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）悬浮，加入玻璃珠，25℃、180r/min振荡30min，静置2min，待沙砾和大颗粒沉降后收集悬浮液，悬浮液5000r/min离心8min，沉淀用5mL PBS悬浮，4℃保存备用。取2mL制备好的样品分别加入含150μg/mL Na2SeO3的100mL液体发酵培养基的三角瓶中，30℃、180r/min振荡培养2d。5%接种量继代培养4次后，稀释平板培养结合划线分离[9]，得到耐硒微生物的纯培养体。

1.3.2 耐硒菌株的生长曲线测定

从斜面上挑取菌株分别接种于含100mL新鲜液体马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基[11]的三角瓶中，于30℃活化12h后，吸取0.5mL分别接种于装有10mL液体培养基的大试管中，取出1管于4℃保藏，其余各管在39℃恒温培养。此后每隔1h取出1管4℃保藏。待全部取出后，用分光光度计在波长530nm处测定吸光度值，绘制耐硒菌的生长曲线。

1.3.3 适宜硒质量浓度的测定

耐硒菌活化后，按5%接种量接种于含硒量为15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL、120μg/mL的装于大试管中的10mL液体培养基中。于39℃恒温培养12h后，根据菌液颜色变化确定适宜硒质量浓度。

1.3.4 硒含量的测定

菌体经过硝解反应后用原子荧光光度计测量荧光强度值，由标准曲线可得样液的硒质量浓度，由转化率计算公式可得，经富硒试验后的耐硒菌的有机硒转化率[10]。

1.3.5 富硒能力的优化

选取对富硒能力影响较大的硒质量浓度、培养温度和加硒时间3个因素做正交试验。以菌体含硒量为评价指标，通过正交试验优化富硒条件。将活化的对数生长期的耐硒菌5mL接种于45mL培养液中，待加入硒后，继续培养12h后取出，3000r/min离心30min，滤去上清液，保存菌体，备用。

1.3.6 富硒微生物的鉴定

CTAB法提取富硒细菌基因组DNA参照蔡刘体等[12]的方法进行。16S rRNA基因序列PCR扩增程序为94℃/5min；94℃/30s；53℃/40s；72℃/120s；30循环；72℃/10min。扩增引物为通用引物F8（5’-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和R1492（5’-ACCTTGTTACGACTT-3’）。扩增产物送美国invitrogen公司进行双向测序。将所得序列在美国国家生物技术信息中心（NationalCenterofBiotechnologyInformation，NCBI）数据库中进行BLAST比对，进行菌种鉴定。

1.4 数据处理

统计学分析采用SPSS 11.0软件，计量资料试验数据以平均值±标准差表示，进行单因素方差分析，多因素间进行方差与极差分析。并用Origin8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 耐硒菌株的生长曲线

由耐硒菌的生长曲线（图1）可以看出，耐硒菌在5h～8h时处于对数期，8h～12h时处于稳定期。因对数期菌体代谢旺盛，转化率高，衰亡期菌体大量自溶，转化率低，且加硒时间越早对菌体代谢活动抑制越强，从转化率和生产周期考虑，选择第6h为加硒时间。

图1 耐硒菌的生长曲线Fig.1 Growth curve of selenium-tolerant microbe

2.2 适宜硒质量浓度的确定

观察不同硒质量浓度的液体培养基，发现随硒质量浓度增加，菌体变红有增加趋势。120μg/mL时红色较深，60μg/mL微红，30μg/mL红色不明显，15μg/mL没变红。为避免过多无机硒转化为单质硒，提高有机硒转化率，认为15μg/mL～25μg/mL可能为合适的硒浓度。

2.3 硒标准曲线

原子荧光光度计测定硒浓度的标准曲线见图2，标准曲线方程为Y=27.03583C+6.0683，R2为0.99962。

图2 硒标准曲线Fig.2 Standard curve of Selenium

2.4 富硒条件优化正交试验优化

根据单因素预试验结果，选取加硒质量浓度、加硒时间和培养温度进行3因素3水平正交试验，因素水平见表1。

表1 正交试验因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal array design

表2 正交试验结果与分析Table 2 Result and analysis of orthogonal experiment

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Analysis of variance for the orthogonal experiment results

由表2可知，3个因子对菌体富硒量影响大小依次为C＞A＞B，即培养温度＞加硒浓度＞加硒时间；最佳工艺为A2B1C2，即选用培养至5h时加20μg/mL硒，在37℃培养12h。由表3可知，加硒浓度、加硒时间和培养温度这3个因素对菌体富硒量的都具有显著影响（p＜0.05）。在最佳条件下进行3次重复试验，菌体硒含量平均为0.7108μg/mL，富硒率为58.3%，因此可得最优水平可靠且该工艺稳定可行。

2.5 富硒微生物的鉴定

显微镜检发现富硒微生物为杆状，革兰氏染色后，菌种呈紫色，说明该菌种是革兰氏阳性细菌。对菌种进行活化，提取细菌总DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图3。表明细菌基因总DNA提取成功。以提取的细菌总DNA为模板，以通用引物F8和R1492扩增16S rRNA基因序列，扩增结果见图4。3次重复均未发现非特异性扩增，且扩增片段大小与预期一致，表明扩增专一性良好，将PCR产物送至华大基因测序中心，测序得到细菌16S rRNA的碱基序列，其长度为1389bp，将序列在NCBI基因数据库中进行BLAST分析，根据比对结果，结合形态学的观察，认为该富硒菌为一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

图3 富硒菌总DNA凝胶电泳图谱Fig.3 Agarose gel electrophoretic of total DNA for seleniumenriched microbe

图4 富硒菌16S rRNA基因扩增片段图谱Fig.4 DNA fragments amplified by F8/R1492 for selenium-enriched microbe

3 结论

世界上有40多个国家和地区缺硒，我国有72%的县是低硒或缺硒地区[13]。给缺硒地区的人民适当补硒可取得良好的医疗效果。由于无机硒的毒性很强，吸收率又低，因此补硒时把有机硒视为最安全有效的手段。目前有机硒的获得包括微生物转化法、植物转化法[14]和动物转化法等。微生物转化法中较多的是利用酵母[9]和乳酸菌[10]，而利用其他微生物进行富硒未见报道。

湖北恩施是富硒地区，被誉为“世界硒都”。本实验从恩施富硒矿区土壤中筛选一株富硒芽孢杆菌，通过富硒工艺条件优化，发现培养温度对菌体富硒量影响最大，加硒浓度次之，而加硒时间的影响不显著，同时获得最大富硒量的最适条件为加硒浓度20μg/mL，加硒时间为培养5h以后，培养温度37℃，在此条件下培养菌体硒含量平均为0.7108μg/mL，富硒率为58.3%。这些结果进一步丰富了利用微生物进行生物富硒的研究，为硒资源的开发和利用提供了一定的基础。

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