张百发，李付丽，卢红梅 *，龙则河，孟天毅

（1.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550003；2.贵州大学 化学工程学院，贵州 贵阳 550003；3.贵州省贵州国台酒业有限公司，贵州 仁怀 564501）

曲虫是在制曲过程中产生的一类专门危害酒曲的害虫，经初步鉴定，酒曲害虫至少有35种，分别隶属两纲五目19科。其中以昆虫纲的鞘翅目昆虫为主，占26种；鳞翅目有5种；啮虫目、蜚蠊目各1种，蜘蛛纲的蜱螨亚纲蜱螨目螨类1个种[3]。关于酒曲害虫对曲药的危害已有众多报道，而蜚蠊目昆虫——蟑螂侵害酒曲的情况目前还未见报道，据初步调查，蟑螂虽然种类单一，但其数量之大相当惊人，其对酒曲的危害也较严重，蛀蚀严重的曲块，几乎只剩一层空壳，经蟑螂啃食后的酒曲，其自身质量大幅下降。随着全球气候变暖，酿酒环境的温湿度也逐步增加，更适宜蟑螂的生长、繁殖，特别是到7月份之后，在酒厂周围随处可见，甚至在职工宿舍也可见其踪影。自“十二五”规划以来，贵州白酒产能增大，制曲能力也相应增加，这无疑给蟑螂的孳生、繁殖提供了更有利的条件。

蟑螂对曲块的危害程度大，根据前期实验结果，个别曲样质量平均损耗率最高可达66.98%，是酒厂重点防治对象。已有相关资料显示[4]，蟑螂能携带、保持并排出病毒，包括柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒等，也有人认为蟑螂可传播肝炎病毒。在提倡健康、卫生型白酒生产的今天，对酒曲害虫——蟑螂采取综合防治是非常必要的，但采用传统的蟑螂防治方法污染严重或效果欠佳[5，6]，难以满足生产要求，用拜乐制剂诱杀酒曲害虫——蟑螂，旨在探索高效无毒的酒曲害虫防治方法。

拜乐制剂由湖北武大绿洲生物科技有限公司提供，在前期的安全性研究过程中，国内众多科研机构对该制剂做了毒理学测试，主要包括：黑胸大蠊浓核病毒和蟑螂病毒饵剂对环境毒理安全性测试；蟑螂病毒感染灵长类体外培养细胞检验测试；蟑螂病毒饵剂安全行毒理学试验测试；蟑螂病毒杀虫剂安全性毒理学试验，测试结果均显示该制剂对动物如兔子、老鼠、鱼均属无毒无害。

1 材料与方法

1.1 材料

器材：纸箱（规格：400mm×340mm×285mm），PHS-3E型酸度计（上海精科天美科学仪器有限公司），HC520型温湿度计（衡水市创新仪器仪表有限公司），SW-CJ-1CU型无菌操作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），YXQ-LS-30SII型高压蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），78-1型电磁搅拌器（江苏省金盘市荣华仪器制造有限公司），GZX 9070 MBE数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），HH-6数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），CP64型电子天平（奥豪斯仪器有限公司）。

武大绿洲拜乐（Bio-killer）：由湖北省武汉武大绿洲生物技术有限公司提供。蟑螂：采集于某酒厂。酱香型大曲：取自某酒厂。

1.2 方法

1.2.1 取样

实验样：将采集于某酒厂蟑螂（250只）分别饲养在5个规格纸箱（规格：400mm×340mm×285mm；摆放在实验室内，温湿度计随时监控温度及湿度的变化，调整并维持蟑螂的最佳生活湿度及温度（湿度：70%～80%；温度：25℃）[7]，添加食料酒曲及水，其中实验组：标记为实验1、实验2、实验3；对照组：标记为对照4、对照5。

1.2.2 处理方式

分别将制剂（0.1g）涂抹在实验组1、2、3号纸箱内酒曲上，第1次施药为饲养后第2天，第2次（剂量同上）施药为饲养后第3天，对照组不做任何处理。

1.2.3 观察记录

实验样：每天测定实验室的温度、湿度，并及时调整纸箱内温度和湿度为最佳；记录蟑螂的死亡数量。

对照样：同实验组。

1.2.4 蟑螂的死亡情况测定

根据实验设计，每两天定时观察并记录实验组和对照组蟑螂的死亡情况，分别记录死亡数量（只），对实验组和对照组进行蟑螂死亡率和校正死亡率的计算。死亡率和校正死亡率计算公式：

1.2.5 样品理化指标及微生物数量检测

检测了各纸箱内曲块微生物数量变化及制剂对酒曲微生物的影响，根据《仁怀市酱香型白酒酿酒工艺规程和操作规范》技术要求[8]，还跟踪了实验组和照组曲样理化指标变化，检测方法参照标准QB/T 4257-2011《酿酒大曲通用分析方法》[9]：

微生物数量测定：稀释倒平板法。

（1）本实验分为2组，实验组和对照组，其中实验组是溶解了该制剂的大曲样液，处理办法：将制剂分散于大曲样液，充分搅拌至其完全溶解；而对照组则为没有溶解该制剂的大曲样液。

（2）采用平板计数琼脂培养基（PCA）和马铃薯葡萄糖培养基（PDA）分别对细菌和酵母菌及霉菌计数。

（3）培养2d～3d后计数。

水分的检测：恒重法。

淀粉含量的检测：淀粉分子在盐酸作用下，被水解生成还原糖。利用菲林溶液与还原糖共沸，生成氧化亚铜沉淀，用次甲基蓝作指示剂，以水解后的样液滴定菲林溶液，达到终点时，稍过量的还原糖将蓝色的次甲基蓝还原成无色，以示终点。根据生成的还原糖折算出淀粉含量；

酸度的检测：酸碱中和法。

糖化力的检测：大曲中糖化型淀粉酶能降淀粉水解生成葡萄糖。试样在规定条件下从淀粉的非还原性末端开始依次水解α-1，4-葡萄糖苷键生成葡萄糖，用菲林法测定所生成的葡萄糖量，以此来表示糖化力，单位mg/（g·h）；

发酵力的检测：CO2重量法，发酵力（以CO2重量计，g/100g）=[（W1-W2）/W]×100（W1为发酵前发酵瓶加内容物重，g；W2为发酵后发酵瓶内容物重，g；W为取样量，g）；

氨基酸态氮：利用甲醛固定氨基的碱性，使羧酸呈酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定至终点，记录消耗的氢氧化钠溶液体积V1；同时做空白试验记录消耗氢氧化钠体积V0。氨基酸态氮含量按下式计算：

式中：X—试样中氨基酸态氮含量，g/kg；V1—试样加入甲醛后滴定至终点时消耗氢氧化钠标准液体积，mL；V0—加入甲醛后滴定至终点，空白溶液消耗氢氧化钠标准液体积，mL；C—氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；20—吸取的样液体积，mL；0.014—氮的毫摩尔量，g/mmol。

2 结果与分析

2.1 蟑螂死亡率

本次实验的始末时间为：2013年5月9日至2013年5月27日，自饲养的蟑螂生活取食状态良好后开始处理（剂量：0.1g/箱），即饲养后第2天和第3天处理，前后两次剂量一样。之后每两天观察1次，经过17d的连续观察，蟑螂的死亡数量逐渐增多，实验组和对照组蟑螂死亡数量见表1。

从表1可看出，用拜乐制剂处理蟑螂，历经17d后，可使蟑螂的最低校正死亡率为86.40%，最高可达97.70%；单箱最低蟑螂死亡数量为44只，最高达49只，蟑螂的致死效果极为显著。另外，经细致观察，发现蟑螂自发酵仓移入纸箱后，仅经过1d的时间，便可适应下来，开始正常取食，在纸箱边角处涂抹制剂后，可观察到有蟑螂迅速来抢食，在1min内便可取食完制剂，之后于第3天继续对实验组施以同样剂量的制剂，同样也可观察到生活状态良好的蟑螂抢来取食，同样可观察到蟑螂在1min内就可将新涂抹的制剂取食完成[10-12]，这充分说明该制剂对蟑螂的引诱作用比大曲还强，这是蟑螂防治的极好切入点；第1次施药后第2天，蟑螂开始出现反应迟钝、行动迟缓等状态，实验组1和实验组3有2只甚至已是半死状态。自第4天起，便不再涂抹制剂，但是仍发现蟑螂开始连续死亡，且随着时间的延长，蟑螂的死亡数量渐增，而根据取食该制剂的蟑螂数量来看，远比死亡数少，这说明该制剂能使蟑螂种群间相互感染致死，达到“一蟑感染，祸害成群”的效果。

表1 拜乐制剂对蟑螂的杀灭效果Table 1 Effect of Bio-killer on cockroachs killing result

另外，在实验开始后第7天，对照组曲块上出现蟑螂卵鞘。实验后第17天，可观察到曲块上蟑螂卵鞘破裂，并在箱底发现有少量幼虫尸体，可见该制剂能致死幼蟑，大大增强灭蟑效果。蟑螂大量啃食酒曲，危害严重的曲块有明显的痕迹，且异臭味明显，对大曲品质造成很大的影响，因此对其采取必要的防治措施显得尤为重要。

2.2 灭蟑前后大曲理化指标变化

根据大曲相关理化指标和检测方法，跟踪了实验前后大曲理化数据，见表2和表3。

表2 实验前曲块的理化性质Table 2 Physical and chemical properties of Daqu samples before experiment

表3 实验后曲块的理化性质Table 3 Physical and chemical properties of Daqu samples after experiment

从表2和表3可以看出，实验前后水分和淀粉含量变化不明显，可能是由于蟑螂的危害时间短和相对稳定的空间环境；而酸度、糖化力、发酵力及氨基酸态氮等含量变化极为明显，其中变化最大的是氨基酸态氮含量和酸度，几乎成整体上升趋势，其中酸度平均升高近40%：氨基酸态氮含量平均增加近79.3%，这可能是由于蟑螂的代谢产物逐渐积累而造成；糖化力变化较大，1号、2号及5号与实验前对比，成下降趋势，且幅度较大，平均下降32.3%；3号、4号糖化力变化异常，已超过酱香型大曲理化指标规定值（50mg/（g·h）～300mg/（g·h））[8]，这可能是由于蟑螂的危害及其代谢产物影响了大曲微生物酶系，特别是霉菌、细菌等微生物群落；另外，对比实验前后，发酵力略有下降，而对照组升高，但均较小。

2.3 微生物数量变化

根据实验要求，跟踪检测了实验前后大曲微生物的数量变化，见表4、表5。

表4 实验前曲块微生物数量Table 4 Number of microbe in Daqu samples before experiment CFU/100g

对比实验前后大曲微生物数量后发现，实验前后：实验组和对照组霉菌、酵母菌及细菌数量均有所变化，实验组霉菌下降了15.5%；细菌下降了76.5%；酵母菌增加了16.5%；而对照组霉菌几乎无变化，细菌总数下降了47.3%；酵母菌总数增加了25%。从表4和表5看出，细菌平均数量变化较大，而霉菌及酵母菌变化稍小，这可能是制剂与大曲直接接触和蟑螂对酒曲微生物影响的共同结果。

表5 实验后曲块微生物数量变化Table 5 Changes of number microbial in Daqu samples after experiment CFU/100g

同时，我们还做了该制剂对大曲微生物的影响实验，数据见表6。

表6 拜乐制剂对大曲微生物的影响Table 6 Effect of Bio-killer on Daqu microbe CFU/100g

从表6可看出，该制剂对大曲微生物有一定的影响，细菌、酵母菌及霉菌数量均有较大幅度下降，其中霉菌下降34.5%；细菌下降71.2%；酵母菌下降41.2%。该制剂对大曲微生物影响较大，可能是由于制剂与大曲完全并充分接触所致，但相比蟑螂对酒曲的危害而言（据在制曲车间发酵仓和干曲仓细致观察，蟑螂的蛀蚀速度惊人且严重，危害严重的曲块只剩下一层空壳，个别曲样平均损耗率高达66.98%）是相对较小的。在后期综合治理时将制剂盛放在专门容器内并置于制曲车间外（如石壁渗水孔、下水道及污水处理站等蟑螂藏身的地方），通过蟑螂的信息素分撒与聚集行为[13-15]使其在出口处便可取食而感染致死，制剂不与大曲直接接触，不会对大曲品质产生影响。

3 小结

通过该实验，得出该制剂对酒曲害虫——蟑螂有良好诱杀效果，在纸箱涂抹该制剂后，蟑螂不断死亡，直至处理后17d，实验组蟑螂最多死亡数量高达49只，最低也有46只；最低校正死亡率为86.40%，最高可达97.70%，说明以该制剂诱杀酒曲害虫蟑螂的效果极为明显。

对比实验前后，曲块水分和淀粉含量变化极小，是由于蟑螂的危害时间短和相对稳定的空间环境；而酸度、糖化力、发酵力及氨基酸态氮等含量变化极为明显，其中变化最大的是氨基酸态氮含量和酸度，几乎成整体上升趋势；糖化力变化较大甚至异常；而发酵力也有所变化，这可能是由于蟑螂的危害及其代谢产物逐渐积累及局部蟑螂种群密度过大而影响了大曲微生物群落所致。对比实验前后，发现大曲的有些理化数据变化范围较大，这可能是蟑螂除了啃食酒曲带来的危害外，也有可能是该制剂对大曲微生物有一定的影响，这还需要今后的更深入的研究。在后期蟑螂治理时，将制剂固定在专门的容器内并安放在蟑螂的集聚点，避免与酒曲直接接触，不会对酒曲带来影响。

在比较实验组和对照组蟑螂死亡数量时，实验组和对照组差异突出，效果显著，说明以该制剂来治理酒曲害虫蟑螂是可行的，对白酒生产企业的蟑螂防治提供了思路。

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