柳佳，张丽，姚映芷，丁安伟，喻斌，单鸣秋，姚卫峰

[摘要] 目的：探讨侧柏炭对血热出血模型大鼠的止血作用及机制。方法：采用干姜水煎剂15 g·kg^-1结合5%乙醇给药15 d建立大鼠血热出血模型，以云南白药为阳性对照药，同时给予侧柏炭水煎剂（5.0，10.0 g·kg^-1）进行治疗，考察大鼠一般体征（体重、饮食量、饮水量、二便及肛温）变化，全自动血细胞分析仪测定白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白含量（HGB）及红细胞压积（HCT），断尾法测定出血时间（BT），血液流变仪测定全血和血浆黏度，凝血仪测定血浆凝血酶时间（TT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）及纤维蛋白原（FIB）含量，放射免疫法检测血浆中与甲状腺功能相关的生化指标三碘甲状腺原氨酸（T3）、四碘甲状腺原氨酸（T4）、反三碘甲状腺原氨酸（rT3）及促甲状腺激素（TSH）水平，病理学检查肺组织变化。结果：造模后大鼠体重增长率减慢，饮食量、饮水量、尿量及体温明显增加，粪便量及粪便含水量明显减少（P<0.05，P<0.01）；血浆T4水平升高、T3和rT3浓度明显增加（P<0.05）、TSH浓度下降；WBC，RBC，HGB及HCT明显升高（P<0.05，P<0.01），全血高、中、低切黏度及血浆黏度显著增加（P<0.01）；BT，TT，APTT显著延长（P<0.01），FIB含量显著增加（P<0.01）。灌胃给予云南白药或侧柏炭后，各组大鼠热象体征有明显改善（P<0.05，P<0.01）；凝血功能指标（BT，TT，APTT，FIB），甲状腺功能指标（T4，T3，rT3，TSH），WBC，RBC，HGB，HCT，全血黏度及血浆黏度渐趋于正常（P<0.05，P<0.01），且光镜下观察发现，各给药组大鼠肺组织病理性出血现象有所改善。结论：侧柏炭可通过抑制甲状腺功能、纠正血液流变学及凝血功能异常，改善血热出血大鼠的热象体征及病理性出血，发挥凉血止血功效。

[关键词] 侧柏炭；血热出血；甲状腺功能；凝血功能；血液流变学；凉血止血

侧柏叶为柏科植物侧柏Platycladus orientalis （L.） Franco的干燥枝梢及叶，又名柏叶、丛柏叶、云片柏。始载于《神农本草经》，列为木部上品，其味苦涩，性寒，归肺、肝、脾经，具有凉血止血、化痰止咳、生发乌发之功效，临床可用于治疗出血、痛风、风湿性关节炎、感冒、咳嗽、支气管炎、哮喘、高血压以及激素混乱引起的多毛症和脱发等疾病[1]。侧柏叶具有止血、抑菌、抗炎、抗氧化、防脱发及神经保护等作用，炒炭后，其寒凉之性减弱，止血功效增强[2]，但止血作用机制及有效成分尚不明确。以往学者大多采用正常动物或体外实验研究侧柏叶的止血功效，而对侧柏炭的研究甚少，本课题组通过前期研究，以干姜水煎剂为造模用药，建立了符合中医临床辨证特点的大鼠血热出血模型[3]，故本实验拟运用该模型对侧柏炭凉血止血功效进行验证，并对其作用机制进行初探。

1 材料

1.1 动物及分组 SD大鼠，SPF级，雄性，体重180～220 g，由浙江省实验动物中心提供，合格证号SCXK（浙）2008-0033。

1.2 药物 干姜饮片购自亳州市永刚饮片厂有限公司（批号120216），经南京中医药大学中药鉴定教研室吴启南教授鉴定为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根茎。生侧柏叶购自河南辉县，经南京中医药大学中药鉴定教研室吴启南教授鉴定为柏科植物侧柏P. orientalis的干燥枝梢和叶。侧柏炭则是将所购生品按药典规定炒至表面焦褐色，内部焦黄色的自制炭品。云南白药购自云南白药集团股份有限公司（批号ZI11023）。

1.3 仪器及试剂 LG-PABER血小板聚集凝血因子分析仪（北京世帝科学仪器公司）；血液流变仪（北京中勤世帝科学仪器有限公司）；MEK-6318K全自动血细胞分析仪（日本光电工业株式会社）；r-911全自动放免计数仪（中国科技大学实业总公司）；离心机（上海安亭科学仪器厂）；DT-1TB电子体温计（上海华晨医用仪表有限公司）；PIR-200红外测温仪（西安启悦测控技术有限公司）；无水乙醇（无锡市亚盛化工有限公司，批号20100612）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，国药集团化学试剂有限公司，批号F20101222）；枸橼酸纳（天津市科密欧化学试剂开发中心，批号20051006）；EDTA（国药集团化学试剂有限公司，批号T20090224）；水合氯醛（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20080323）；试剂盒：凝血酶时间（TT，批号STG20301-35A）、纤维蛋白原（FIB，批号STG20401-35）、凝血酶原时间（PT，批号STG20101-49）、活化部分凝血活酶时间（APTT，批号ST20201-55），均购自北京中勤世帝科学仪器有限公司。放免试剂盒：三碘甲状腺原氨酸（T3，批号20120402）、四碘甲状腺原氨酸（T4，批号20120405）、反三碘甲状腺原氨酸（rT3，批号20120401）、促甲状腺激素（TSH，批号20120409）均购自北京华英生物技术研究所。

2 方法

2.1 供试品的制备 称取适量羧甲基纤维素钠粉末，加水煎煮至粉末完全溶解，制成0.5% CMC-Na溶液。称取干姜饮片适量，加8倍量水浸泡1 h，煎煮1 h，趁热过滤，残渣再加8倍量水煎煮2次，每次1 h，趁热过滤；合并3次滤液并浓缩至1.5 kg·L^-1，即为干姜水煎剂。称取云南白药粉末适量，用0.5% CMC-Na溶液研匀，配置成质量浓度为0.05 g·mL^-1的混悬液，即为云南白药混悬液。取生侧柏叶适量，按《中国药典》2010版一部（附录ⅡD）侧柏炭（Platycladi Cacumen Carbonisatum，PCC）炮制方法制备标准侧柏炭饮片；称取侧柏炭适量，加15倍量水煎煮2次，每次2 h，趁热过滤，合并滤液并浓缩成浸膏；称取该浸膏适量，以0.5% CMC-Na溶液溶解并稀释至1.0，0.5 g·mL^-1（按生药量计算），即为侧柏炭水煎剂高、低剂量。以上药液均置于0 ℃冰箱保存备用。侧柏炭高、低剂量分别为临床等效剂量的8倍和4倍，即10.0，5.0 g·kg^-1。

2.2 造模及给药 将大鼠置于温度18～27 ℃，湿度45%～75%，气流10～25 cm·s^-1，噪音低于50分贝的安静环境中饲养。大鼠随机分为5组：空白组、模型组、阳性组、侧柏炭高、低剂量组，每组8只。空白组大鼠自由饮水，其余各组大鼠以5%乙醇代替自由饮水。早晨，模型组、阳性组、侧柏炭高、低剂量组大鼠灌胃给予干姜水煎剂，给药体积为10 mL·kg^-1（体重），空白组给予等体积蒸馏水；7 h后，阳性组灌胃给予云南白药混悬液，侧柏炭高、低剂量组分别给予10.0，5.0 g·kg^-1的侧柏炭水煎液，空白组和模型组给予等体积0.5% CMC-Na溶液，给药体积均为10 mL·kg^-1（体重），连续给药15 d。

2.3 饮食量、饮水量、尿量、粪便量及体重增长率测定 分别于给药第7天和第14天，将各组大鼠置于代谢笼中饲养，以24 h为时间单位，监测各组大鼠饮食量、饮水量、尿量及粪便量的变化，连续观察2 d，并计算各组大鼠每100 g体重的饮食量、饮水量、尿量和粪便量，取其平均值。分别于给药前和给药后第15天，测定各组体重，并计算体重增长率=（第15天体重-给药前体重）/给药前体重×100%。

2.4 粪便含水量测定 分别于给药第7天和第14天，每组大鼠各取新鲜粪便1粒，测得湿重后，置烘箱105 ℃干燥5 h后，冷却至恒重，测得其干重，并计算粪便含水量= [（湿重-干重）/湿重]×100%。

2.5 肛温测定 于给药前、给药7 d后及给药14 d，分别测定各组大鼠肛温。

2.6 血常规测定 第14天，灌胃干姜水煎剂40 min后，各组大鼠眼眶静脉丛采血，EDTA 1∶9抗凝，测定WBC，RBC，HGB和HCT。

2.7 出血时间的测定 第14天，灌胃给予治疗药物40 min后，按文献方法[4]，在距尾尖5 mm处横断，开始记录时间，并用滤纸蘸血，每隔30 s蘸1次，直至出血停止，即为出血时间。

2.8 血液黏度及凝血功能指标测定 第15天，给药40 min后，各组大鼠以10%水合氯醛麻醉，颈总动脉取血，3.8%枸橼酸钠1∶9抗凝，1 mL全血分装测定全血高、中、低切黏度，剩余全血以3 000 r·min^-1离心10 min，取血浆，测定血浆黏度，TT，APTT，FIB及PT。

2.9 甲状腺功能相关生化指标测定 取血浆，按试剂盒说明书操作，测定各组大鼠血浆中T3，T4，rT3和TSH的浓度。

2.10 组织学检查 大鼠取血后，处死，取肺组织，生理盐水清洗，肉眼观察出血情况。取右肺叶以10%甲醛固定，石蜡包埋、苏木素-伊红染色、切片，光镜下观察组织的病理变化。在100倍光镜下选取5个不重叠的视野，根据①肺泡壁增厚程度、②肺间隔充血、③间质出血、④肺泡腔狭窄、⑤炎症细胞浸润评价肺损伤程度，每项评0～4分，0分，正常；1分，轻度即累及<25%肺组织；2分，中度即累及25%～50%肺组织；3分，重度即累及50%～75%肺组织；4分，极严重即累及>75%肺组织[5]。

2.11 统计学方法 实验数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析，各组数据以±s表示，各组间比较采用t检验分析，P﹤0.05为有统计学意义。

3 结果

3.1 侧柏炭对血热出血模型大鼠一般体征的影响 与空白组比较，模型组大鼠体重增长率减慢（P<0.01），饮食量、饮水量、尿量及肛温明显升高（P<0.05，P<0.01），粪便量及粪便含水量减少（P<0.01）。与模型组比较，云南白药可明显提高大鼠体重增长率（P<0.05），使饮水量、尿量及肛温明显下降（P<0.05，P<0.01），粪便量及粪便含水量明显增加（P<0.05）；高、低剂量的侧柏炭水煎剂均可使体重增长率显著提高（P<0.01），饮食量、饮水量、尿量及肛温显著降低（P<0.05，P<0.01），粪便量及粪便含水量明显增加（P<0.05，P<0.01），见表1。

3.2 侧柏炭对血热出血模型大鼠血常规及血液流变学相关指标的影响 与空白组比较，模型组大鼠WBC，RBC，HGB，HCT明显增加（P<0.05，P<0.01），全血高、中、低切黏度及血浆黏度显著增加（P<0.01）。与模型组比较，云南白药可使血热出血模型大鼠WBC，RBC，HGB和HCT明显减少（P<0.05，P<0.01），全血高、中、低切黏度及血浆黏度明显降低（P<0.05， P<0.01）；高、低剂量的侧柏炭水煎剂均可明显降低WBC，RBC，HGB，HCT，全血各切变率黏度及血浆黏度（P<0.05， P<0.01），见表2， 3。

3.3 侧柏炭对血热出血模型大鼠凝血功能相关指标的影响 与空白组比较，模型组大鼠BT，TT和APTT显著延长（P﹤0.01），FIB含量显著增加（P﹤0.01），PT明显缩短（P﹤0.01）。与模型组比较，云南白药可明显缩短血热出血模型大鼠BT，TT和APTT（P﹤0.05，P﹤0.01），显著降低FIB含量（P﹤0.01），使PT明显延长（P﹤0.05）；高、低剂量的侧柏炭水煎剂可明显缩短BT，TT和APTT（P﹤0.05，P﹤0.01），使FIB含量明显降低（P﹤0.05，P﹤0.01），PT明显延长（P﹤0.05，P﹤0.01），且随剂量增加作用越明显，见表4。表3 侧柏炭对血热出血模型大鼠全血及血浆黏度的影响 （±s，n=8）

3.4 侧柏炭对血热出血模型大鼠甲状腺功能相关指标的影响 与空白组比较，模型组大鼠血浆T4含量有升高趋势，T3，rT3浓度明显增加（P﹤0.05），TSH浓度有降低趋势。与模型组比较，云南白药可明显降低血热出血模型大鼠血浆中T4，T3水平（P﹤0.05，P﹤0.01），使rT3浓度有下降趋势；高、低剂量的侧柏炭水煎剂均可明显降低血浆中T4，T3，rT3浓度（P﹤0.05，P﹤0.01），使血浆TSH水平明显升高（P﹤0.05），见表5。

3.5 侧柏炭对血热出血模型大鼠肺组织的影响 空白组大鼠肺间隔及支气管结构清晰，肺泡结构清晰，上皮完整，肺泡壁毛细血管无扩张，腔内无渗出物，无出血。造模后大鼠肺泡间隔毛细血管扩张充血，纤维组织增生，肺间质出血，肺泡腔内多有红细胞浸润，部分肺泡结构被破坏，局部有炎细胞浸润（P﹤0.01）。治疗后，云南白药及侧柏炭水煎剂低、高剂量可显著抑制炎细胞浸润（P﹤0.01），明显改善肺间质出血、间隔充血、肺泡壁增厚等病理改变（P﹤0.05，P﹤0.01），对血热出血模型大鼠肺出血表现出不同程度的止血作用，见表6，图1。

4 讨论

本课题在前期研究中建立了符合中医临床辨证用药特点的大鼠血热出血模型[3]，通过预试验发现，侧柏炭水煎剂2.5 g·kg^-1（相当于临床等效量的2倍）对该血热出血模型止血效果不佳，故本试验采用5.0，10.0 g·kg^-1剂量的侧柏炭水煎剂为研究对象，初步探讨其止血作用及机制。

干姜水煎剂可通过促进肝糖原分解、提高琥珀酸脱氢酶（SDH）活性，促进ATP的生成，并通过提高肝组织中Na⁺-K⁺-ATP酶及Ca²⁺-ATP酶活性，促进ATP的消耗[6]；甲状腺激素可通过诱导细胞膜 上Na⁺-K⁺-ATP酶的生成，促进ATP分解，增加机体耗氧量，使产热增加。血循环中甲状腺激素的水平受下丘脑-垂体-甲状腺轴的调节，下丘脑室旁核神经元分泌的促甲状腺激素释放激素（TRH）作用于垂体神经元，促进TSH分泌，TSH作用于甲状腺以维持血液中T3，T4的正常，同时，血液中甲状腺激素含量的变化可反馈性调节下丘脑TRH和垂体TSH分泌[7]。本实验中，模型组大鼠血浆中T4，T3及rT3含量升高，TSH含量有下降趋势，结合其肛温升高、饮食量增加及体重增长率下降等一般体征变化，说明干姜水煎剂可通过促进甲状腺激素T4，T3分泌，加速ATP消耗，提高机体的物质和能量代谢，使大鼠体温升高、食欲增加，而体重增长率较慢，血循环中T3，T4水平升高又可反馈性抑制TSH分泌，使血液中TSH浓度下降；云南白药粉末及高、低剂量的侧柏炭水煎剂可显著抑制T4，T3，rT3的分泌和生成，使大鼠体温和饮食量下降、体重增长率增加，血循环中TSH浓度也相应升高，且随给药剂量增加侧柏炭的作用越明显。

血液黏度主要由红细胞压积、血浆黏度、红细胞聚集性、红细胞变形性等内在因素决定，其黏度值越大，血液流动性越差。HCT是影响全血黏度的重要指标之一，其增加可导致各切变率下全血黏度增加。血浆黏度主要由纤维蛋白原、球蛋白、白蛋白、脂类等因素决定，尤以纤维蛋白原含量对其影响最大。在本实验中，模型组大鼠饮水量、尿量均明显增加，而尿量增加幅度大于饮水量增加幅度，同时粪便量及粪便含水量显著减少，全血高、中、低切黏度及血浆黏度显著增加，RBC，HCT，HGB及FIB含量明显增加，表明干姜辛热之性入血分可耗伤津液，造成体内水分流失，使血液浓缩、黏滞性增加，导致全血及血浆黏度增加、凝血功能异常；而云南白药粉末和高、低剂量侧柏炭水煎剂可通过改善大鼠饮水量、尿量、粪便量及粪便含水量等一般体征，降低RBC，HCT，HGB及FIB含量，使全血及血浆黏度下降，从而改善血液流动性。

凝血过程主要包括内源性凝血途径、外源性凝血途径和共同凝血途径。PT主要反映的是外源性凝血系统功能，其延长或缩短可表明血浆中外源性凝血因子水平降低或升高；APTT和TT的延长与内源系统凝血酶的抑制有关，其延长或缩短可表明血浆中凝血因子Ⅻ，Ⅺ，前激肽释放酶Ⅴ，Ⅱ和Ⅰ水平的降低或升高[8]。本实验中，模型组大鼠TT，APTT显著延长，PT缩短，WBC及FIB含量增加，且病理学检查可见肺组织局灶性出血及炎细胞浸润，提示干姜长时间给药可引起大鼠内源性凝血功能障碍及血液高黏状态，导致大鼠肺出血；而云南白药粉末及高、低剂量侧柏炭水煎剂可显著降低全血黏度及血浆黏度，明显降低FIB含量，显著抑制炎细胞浸润，且病理学观察可见各给药组大鼠肺组织出血状态均有不同程度改善，提示侧柏炭水煎剂可通过改善血液粘稠度态、纠正凝血功能异常，发挥止血功效。

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Effects and mechanisms of Platycladi Cacumen Carbonisatum on rats with

blood-heat and hemorrhage syndrome

LIU Jia1， ZHANG Li1， YAO Ying-zhi2， DING An-wei1*， YU Bin3， SHAN Ming-qiu1， YAO Wei-feng1

（1. Jiangsu Key Laboratory for High Technology Research of Traditional Chinese Medicine Formulae， Nanjing University of

Chinese Medicine， Nanjing 210046， China； 2.Basic Medical School， Nanjing University of Chinese Medicine，

Nanjing 210046， China； 3. Province and Ministry Cooperation Lab of Pharmacology of Chinese Medicine， Nanjing University of

Traditional Chinese Medicine， Nanjing 210046， China）

[Abstract] Objective： To discuss the effect and mechanism of Platycladi Cacumen Carbonisatum（PCC） on rats with blood heat and hemorrhage syndromes. Method： Rats were fed with 15 g·kg^-1 water decoctions of Zingiberis Rhizoma and 5% alcohol for 15 days to establish the blood-heat and hemorrhage syndrome model. Yunnan Baiyao was taken as the positive control drug， and PCC decoctions （5.0， 10.0 g·kg^-1） were given simultaneously， in order to detect changes in general physical signs of rats， such as body weight， daily diet， volume of daily drinking and urine and stool， and rectal temperature. Automatic hematology analyzers was used to determine white blood cell （WBC）， red blood cell （RBC）， hemoglobin （HGB）， and hematocrit （HCT）， blood time by docking （BT）. Blood rheometers was used to detect whole blood and plasma viscosities， thrombin time （TT）， activated partial thromboplastin time （APTT）， prothrombin time （PT） and fibrinogen content （FIB）. Indexes related to thyroid functions， such as triiodothyronine （T3）， tetraiodothyronine （T4）， reverse triiodothyronine （rT3） and thyroid stimulating hormone （TSH） were measured by radio-immunoassay， and changes in lung tissues were observed by hematoxylin-eosin （HE） stain. Result： After modeling， rats witnessed slowdown in weight growth rate， significant increase in daily diet， volume of daily drinking， urine and temperature， significant decrease in stools and their water content （P<0.05， P<0.01）， rise in plasma T4 level， notable growth in T3 and rT3 concentrations （P<0.05）， decline in TSH concentration. Additionally， their WBC， RBC， HGB and HCT remarkably increased （P<0.05， P<0.01）， with significant increase in high， middle and low whole blood viscosities and plasma viscosity （P<0.01）； their BT， TT， APTT were notably prolonged （P<0.01）， with significant increase in FIB content （P<0.01）. After oral administration of Yunnan Baiyao or PCC， rats of all groups showed significant improvement in blood heat syndromes （P<0.05， P<0.01）， and their blood coagulation indexes including BT， TT， APTT， FIB， thyroid function indexes including T4， T3， rT3， TSH， WBC， RBC， HGB， HCT， whole blood viscosity and plasma viscosity were getting normal （P<0.05， P<0.01）. Conclusion： PCC can ameliorate blood heat symptoms and pathologic hemorrhage among rats with blood heat and hemorrhage syndromes by inhibiting thyroid functions and correcting hemorheological and coagulation disorders.

[Key words] Platycladi Cacumen Carbonisatum； blood heat and hemorrhage syndromes； thyroid function； blood coagulation； hemorheology； to cool blood and stop bleeding

doi：10.4268/cjcmm20130216

[责任编辑 张宁宁]