王 英，综述;王雪梅，方 强，校审

结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的一种严重危害人类健康的重要传染性疾病。根据WHO 发布的《2011 年全球结核病(TB)控制报告》［1］，患结核病的人数降到2010 年的880 万，结核病死亡数降到140 万人，结核病死亡率在1990 年和2010 年之间下降了40%，除非洲之外，其他区域都可按期实现到2015 年时使死亡率降低50%这一目标;但是流动人口剧增、结核菌与艾滋病毒双重感染和耐药结核菌病的增多均增加了结核病防治工作的难度，使得结核病疫情的形势依然严峻，防治任务仍然十分艰巨。在艾滋病感染患者中结核的发病率则更高，艾滋病毒携带者同时感染了结核分枝杆菌后，发生结核病的可能性是正常人的34 倍。

卡介苗(BCG)作为目前预防结核病唯一获批使用的一种疫苗，在结核病预防中具有举足轻重的作用，近年来，已组织BCG 标准化的工作［2］，但许多研究表明，BCG 对儿童有较好的保护效果，但预防成人结核病的作用仍然有限。近来的研究不断证明，BCG 接种可降低儿童的结核病风险，而且BCG作为一种活疫苗本身存在潜在的致病力，尤其是免疫损伤或缺陷的个体［3］。所以加快包括满足HIV 感染个体需要在内的新型疫苗的研发十分迫切!国内外许多学者已做了大量的工作，如寻找具有更高保护效力的结核杆菌抗原分子、探索更为安全有效的候选抗原分子形式，或通过不同途径提高现有疫苗的保护力。

1 ESAT6 介绍

ESAT6 即6kDa 早期分泌性抗原靶(6kDa early secreted antigenic target)，为ESAT6 家族中的一种，主要存在于结核杆菌早期培养滤液中，由MTB RD1 区的ESAT6 基因编码，含288bp、95 个氨基酸，理论分子量为9904 Da，用SDS-PAGE 测得天然ESAT6 的迁移率同6kDa 的多肽相符而得名［4］。Sorensen 等用Western blot、Southern blot 以及PCR 等从基因和蛋白水平分析了ESAT6 的分布，除存在于MTB 培养物滤液中，细胞浆和细胞壁中也存在，但不存在于细胞膜上，而且ESAT6没有信号肽序列，表明其可能是通过一种非信号肽形式分泌到细胞外。ESAT6 仅在致病性分枝杆菌中表达，其他BCG 亚株和非致病分枝杆菌均不表达［4］。ESAT6 是结核病早期调节细胞免疫的重要蛋白，其参与刺激T 细胞的增殖和诱导巨噬细胞的凋亡，是抗结核免疫反应的主要配体，有多个T、B 细胞及迟发型超敏反应表位，有较强的免疫原性和免疫反应性［5］。实验表明，ESAT6 CD4 +T 淋巴细胞抗原决定簇能被不同遗传背景的T 淋巴细胞识别，产生大量IFN-γ［6］，而IFN-γ 显著活化巨噬细胞，以提高巨噬细胞对胞内MTB 的抑制作用和杀伤能力［7］。ESAT6 也能诱发宿主产生特异性CD8 + T 淋巴细胞，参与抗MTB 感染的免疫反应。一些研究表明，RD1 介导的毒力与ESAT6 的分泌有关，灭活ESAT6 和CFT10 基因，或者分泌系统基因，可使结核杆菌在巨噬细胞内的生长减少及感染鼠模型表位的减少［8］。因此，ESAT6 作为一个有前景的疫苗候选分子在结核疫苗研究中受到了广泛的关注。

2 ESAT6 新型疫苗的类型

根据疫苗结构的完整性可分为:重组BCG、亚单位疫苗、DNA 疫苗和活载体疫苗等;根据应用方式不同，疫苗又可分为治疗性疫苗和预防性疫苗。治疗性疫苗具有治疗疾病的作用，是指在已感染结核分枝杆菌的机体内，通过疫苗免疫调动宿主的免疫能力，杀伤入侵的结核分枝杆菌，从而起到治疗或辅助化学药物治疗的作用。而预防性疫苗是指人们习惯所说的传统意义上的疫苗，主要起到预防疾病的作用。结核疫苗在近几十年里，有了长足的进展，一部分已经进入了临床第一期实验，还有一部分进入了第二期、三期临床实验。

2.1 亚单位疫苗 亚单位疫苗是利用致病菌的亚单位，特别是抗原表位，理想的亚单位疫苗应该由几个保护性抗原或抗原表位组成。如用MTB 成分作疫苗组份来诱导机体产生免疫保护或免疫治疗作用。蛋白质多肽疫苗主要考虑抗原和佐剂的选择，由于单个抗原的抗原谱窄引起的免疫保护效率有限，因此将多个抗原或多肽融合表达有利于提高疫苗的免疫保护效果，因重组蛋白的免疫原性较弱，重组蛋白须与佐剂联合使用才能满足亚单位疫苗的要求，近几年进入临床阶段的亚单位疫苗无不采用了强大的佐剂来增强疫苗的免疫原性［9］。

Brandt 等［10］将ESAT6 蛋白质与佐剂二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)及单磷脂A(MPL)混合皮下注射免疫小鼠3 次后，用结核杆菌H37Rv 进行攻击，通过测定小鼠肝、脾、肺的结核杆菌荷菌量和IFN－γ 水平，说明ESAT6 +DDA+MPL 组的免疫保护作用达到了BCG 组的水平，表明ESAT6 可作为抗结核亚单位疫苗的有效成分。Jes Dietrich 等构建了Ag85B －ESAT6 融合蛋白，与佐剂LTK63 联合并采用鼻内黏膜给药，发现分泌IFN-γ 的CD4 细胞产生强烈的Th1 反应，对MTB 有长时间、持续的保护力，保护作用与BCG 相当。此外，BCG 初免，Ag85B-ESAT6/LTK63 加强免疫，结果表明，攻毒后肺部产生的抗结核病专一性的CD4 T 细胞明显高于BCG 组［11］。丹麦国立血清研究所研制的Ag85B-ESAT6 融合蛋白疫苗，以寡脱氧核苷酸和多阳离子氨基酸的混合物(IC31)为佐剂在小鼠和灵长类动物中的免疫保护力要高于单一的ESAT6 或Ag85B蛋白疫苗，并能增强BCG 的免疫保护力，目前正在进行Ⅱ期临床试验［12］。

2.2 重组卡介苗 重组卡介苗是将BCG 作为工程菌，将外源基因导入BCG 中，并在宿主内复制，表达多种外源抗原，以诱导特异性体液免疫和细胞免疫。目前国内外关于MTB 分泌蛋白重组卡介苗的研究，主要集中于ESAT6、Ag85B 、38000蛋白、A995A［13］等几种蛋白上。Demange 等［13］发现ESAT6 －卡介苗重组疫苗比卡介苗在机体内的存活时间长，抗结核菌的效力更强;Pym 等发现用ESAT6-卡介苗重组疫苗免疫后再用MTB 攻击，病理改变及病原菌的传播都较轻，保护力却比卡介苗强。张灵霞等重组ESAT6-卡介苗的实验结果也证明了这一结论。结核分枝杆菌特异性抗原ESAT6、Ag85A、MPT64、Ag85B 卡介苗重组疫苗的免疫原性实验表明各卡介苗重组疫苗均能刺激小鼠产生T、B 淋巴细胞免疫反应，而且ESAT6 重组卡介苗组刺激T 淋巴细胞的能力强于卡介苗，对结核杆菌的预防作用也强于卡介苗［14-15］。目前美国加利福尼亚大学洛杉矶分校医学院研制的rBCG30 疫苗，诱导的免疫反应和保护效率均强于BCG，现已完成Ⅰ期临床实验［16］。

2.3 DNA 疫苗 DNA 疫苗是20 世纪90 年代产生的一种疫苗形式，DNA 疫苗注入机体后，被肌肉细胞摄取并进入细胞核内，抗原基因在细胞核内被转录成为mRNA，在细胞质中被翻译为蛋白质，表达特定的抗原而诱导免疫反应的产生，从而刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，达到预防和治疗疾病的目的。过去的研究发现DNA 疫苗引起的免疫反应属于TH1型细胞免疫反应的占优势，它能在机体内诱导T 细胞产生IFN－γ、激活巨噬细胞及杀死感染细胞，产生保护性免疫反应。根据DNA 疫苗上目的抗原的数量可以把DNA 疫苗分为单价、多价或融合DNA 疫苗。单价DNA 疫苗诱导产生的免疫应答和免疫记忆都不够理想，通过佐剂联合使用能获得更加稳定、更加持久的免疫效果［17］。多种MTB 抗原的编码基因可作为DNA 疫苗的主要靶抗原［18］，部分抗原免疫小鼠后用MTB 攻击证实可以提供不同程度的保护［19］。联合应用相关的细胞因子作为佐剂则可以募集并激活专职性抗原递呈细胞到局部感染区，进而有效地递呈抗原，激起抗原特异性T 细胞免疫应答，以抵抗细菌的感染。根据免疫方式的不同，又可分为单次免疫和基础－加强免疫。此外，DNA 疫苗还具有一定的免疫治疗作用。

王庆敏等［20］证明ESAT6 DNA 疫苗能在小鼠体内诱导特异性免疫反应，尤其可诱导较强的T 细胞反应和分泌高水平的IFN-γ。Steven C Derrick 等［21］发现小鼠经ESAT6-Ag85B 融合DNA 疫苗和BCG 免疫后小鼠在MTB 小剂量气雾攻击28 d后，有相似的肺部病理指标和荷菌量，而在生存实验中，两者死亡的平均时间没有明显差别。

郝牧等［22］发现IL-12 与ESAT6 基因联合免疫，较单独的ESAT6 基因免疫，可刺激机体产生更加强烈而稳定的细胞免疫应答。IL-12 与ESAT6 联合免疫时使用剂量是ESAT6 单独免疫时的一半，但诱导的免疫反应却明显强于ESAT6 单独免疫，并与BCG 免疫相当。范雄林等以ESAT6 为基础的DNA疫苗与BCG 联合应用证实，BCG 缺失而MTB 特异表达的蛋白可以异源性增强免疫，进一步的研究说明以BCG 缺失基因为基础的融合蛋白DNA 疫苗可以增强BCG 初免小鼠和牛抗MTB 感染的保护性［23-25］。LI［26］等通过Ag85A-ESAT6 嵌合DNA 疫苗初免，再用Ag85A 和ESAT6 蛋白加强免疫，结果发现联合免疫引起了更高的体液免疫反应。其他研究也表明［27］，通过DNA 基础免疫后蛋白加强免疫，能改进抗原特异性细胞的免疫反应，对抵抗结核杆菌感染有非常重要的作用。

2.4 活疫苗 活疫苗包括减毒活疫苗和基因重组活疫苗，是对MTB 或BCG 进行改良以减少前者的致病力或提高后者的免疫保护效力。主要包括表达分枝杆菌T 细胞抗原的重组活疫苗，表达细胞因子的重组BCG，MTB 营养缺陷型突变株，MTB 减毒活疫苗或其他的弱毒及无毒分枝杆菌活菌苗，研制的关键是希望其免疫原性和安全性能取代BCG 的初种疫苗。

基因重组活疫苗:是利用基因工程技术将外源基因导入分枝杆菌或其他活细菌，活病毒中，依靠细菌病毒在宿主内复制，表达外源抗原，以诱导机体产生特异性的体液和细胞免疫，使表达细胞因子的重组BCG 的免疫原性增强。基因工程菌疫苗不仅具备佐剂和载体功能同时又具有多种外源抗原与活疫苗作用，一次接种可获得强而持久的特异性免疫。研究发现表达ESAT6 的重组腺病毒疫苗可增强感染小鼠肺部结核杆菌的清除率，减少特异性炎症病灶的程度，并改变了肉芽肿的细胞组成［28］。现已有几种结核病基因重组活疫苗进入临床试验阶段［29-30］。

2.5 抗结核转基因植物疫苗 转基因植物疫苗是用转基因方法将外源保护性抗原基因导入可食用植物基因组中，并在在植物中稳定表达和积累，人类和动物通过食用而达到免疫和接种的目的。植物作为生物反应器能有效地进行翻译后加工;而且利用植物生产疫苗蛋白易口服、成本低、安全性好，转基因植物只表达组分疫苗，不含致病或潜在致病的微生物，对人畜安全［31］。通过转基因植物生产结核杆菌口服疫苗，不但可以改变传统疫苗的生产方式和接种手段，还会大幅度降低疫苗的生产成本，具有潜在的社会意义和经济效益。

张更林等［32］将结核杆菌分泌蛋白ESAT6 基因，进行了修饰改造，构建了植物表达载体和根癌农杆菌工程菌，采用叶盘法转化热带水果番木瓜，成功的获得了表达ESAT6 的转基因番木瓜。李君武等［33］成功构建了玉米特异启动子驱动下结核HSP65 与ESAT－6 融合基因表达载体，为成功研制转基因植物并生产抗结核口服疫苗奠定了基础。目前利用转基因植物生产病原微生物亚单位疫苗，还有外源基因在植物中的表达量和转基因植物疫苗的生物安全性、免疫原性和免疫耐受等问题有待解决［34］。

综上所述，ESAT6 蛋白具有高度特异性和免疫活性，不仅是抗结核免疫的靶抗原，还是结核杆菌感染记忆免疫应答的主要抗原。通过重组BCG 疫苗、DNA 疫苗、亚单位疫苗以及活疫苗等的动物实验已初步显示出较好的免疫效果，但是这些疫苗的有效性和安全性还值得进一步验证，有必要建立一种更为有效的体内外疫苗评价模型，同时也需建立一种简单、有效的免疫学检测方法用于这些疫苗的效果评价。尽管很多候选疫苗已经陆续进入了临床试验，但其离真正成为能够广泛应用的疫苗还有很长的路要走。我们相信，在全世界科学家的共同努力下，人们一定能够攻克结核疫苗研究的难关，研制出安全、有效、经济的新型结核疫苗，并制定出合理的疫苗接种方案。

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