邓建忠,金建华,陆文斌,王 芳,李献文

(江苏大学附属武进医院肿瘤内科,江苏常州,213002)

胃癌是中国最常见的胃肠道肿瘤之一,因其早期症状不明显,大多数患者被确诊时病程已至进展期。Survivin是新近发现的一种凋亡抑制基因,选择性地在肿瘤中表达。作者前期研究发现,其也表达于胃癌患者的外周血中,而且具有抑制细胞凋亡,调控细胞周期及参与血管形成的作用[1]。因此,检测外周血中Survivin的表达,有可能成为检测肿瘤复发或转移及判断预后的参考指标之一。本研究旨在探讨外周血survivin mRNA的表达水平与胃癌发生、发展的作用及预后价值。

1 材料与方法

1.1 材料

选择2007年10月～2009年8月在江苏大学附属武进人民医院肿瘤科、消化内科和外科就诊并经胃镜活检组织及术后病理确诊为胃癌患者55例(转移28例,未转移 27例),男 30例(转移19例,未转移 11例),女 25例(转移 17例,未转移8例)。年龄 32～72岁,中位年龄 58岁。TNM 分期:Ⅰ期3例,Ⅱ期9例,Ⅲ期15例,Ⅳ期28例。采用2002年第6版AJCC胃癌TNM分期标准进行分期。所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 外周血总RNA的提取、完整性和纯度检测:根据试剂盒操作说明,应用Trizol Reagant按照说明书进行提取RNA,所提取的总RNA用紫外分光光度计定量并检测其纯度。A260/A280≥1.8为合格。所提取的总RNA完整性经琼脂糖电泳鉴定。-70℃保存待用。

1.2.2 cDNA 合成:20 μL反应体系中含:总RNA 1 μg,10 ×缓冲液 2 μL,dNTPs(10 mmol/L)2 μL,100 ng 随机引物 ,M-MLV(10 U/μL)2 μL,加DEPC水至20 μL。逆转录反应条件为:37℃60 min,95℃5 min,70℃保存待用。

1.2.3 实时荧光定量PCR(RT-PCR):利用DNAman软件设计RT-PCR Survivin和管家基因GAPDH的引物:GAPDH上游引物为 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,下游引物为5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′, 探针序列为 5′-CAAGCT TCCCGTTCTCAGCC-3′;Survivin上游引物为5′-TGCCCCGACGTTGCC-3′, 下游引物为 5′-CAGTTCTTGAATGTAGAGATGCGGT-3′,探针序列为 5′-CCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACC-3′。……