张子华,吴海峰,杨锋荣,胡 浩,李恒建,白 霞

(江苏省吴江市中医医院普外科,江苏吴江,215221)

大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一,肿瘤转移是导致病死的主要原因,肿瘤浸润和转移是临床治疗失败的主要因素。随着对肿瘤侵袭转移机制的认识,发现有很多生物活性分子参与肿瘤的转移与浸润,其中主要包括乙酰肝素酶,该物质是一种内源性的葡萄糖酸酯酶,能够水解细胞表面、细胞外基质的乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)的多糖侧链,促进肿瘤细胞侵人基质和血管壁[1],因此将乙酰肝素酶作为靶向治疗点成为研究的热点,国内外关于乙酰肝素酶的研究很多,但关于其与大肠癌的相关研究报道甚少,本文采用基因干扰的方法,研究乙酰肝素酶siRNA在大肠癌中作用,为大肠癌的临床治疗,特别是在基因治疗方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

SW620细胞在37℃,5%CO2条件下传代培养。胰酶及噻唑蓝(MTF),佛波酯,二甲基亚砜(DMSO),Tr-answellTM培养板。IGO150CO2培养箱,Leica荧光倒置显微镜。SPF级裸小鼠20只购买自南京医科大学动物中心。Trizo总RNA提取试剂盒购自sigma公司。乙酰肝素酶siRNA购自日本 TaKaRa公司。定量实时 PCR引物购自日本Life Science公司。Hpa(H-80)兔抗人多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司,即用型SP-9000检测试剂盒以及 DAB显色试剂盒均购自北京中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 转染:选取对数期生长的大肠SW620癌细胞,胰酶消化法收集细胞,实验组(n=6)使用转染试剂将siRNA经逆转染法[2]导入大肠SW620癌细胞,将细胞悬浮液接种在24孔培养板中,21 h后待细胞融合70%左右时,用构建的乙酰肝素酶siRNA转染到大肠SW620癌细胞,48 h后用荧光显微检测其转染率。……