吴 莺，孙海波，艾宽宽，何亚龙，魏金文，徐 岷，周 红

（1.江苏大学附属医院消化科，江苏镇江212001；2.江苏大学医学基础与医学技术学院，江苏镇江212001）

幽门螺杆菌（helicobacter pylori，Hp）与胃癌的发生密切相关，其致癌机制仍不十分明确［1］。体内及体外的研究显示，Hp可以刺激胃上皮细胞的增殖［2］。Bcl－xl基因是一种抗凋亡基因，研究显示，Bcl－xl基因在肿瘤的发生发展中扮演着重要的作用［3－4］。RNA干扰技术是与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。本研究用东亚型（W24）及西方型（11637）［两种菌株均为cagA阳性（＋）菌株］Hp超声裂解液处理胃癌BGC－823细胞，探讨Hp超声裂解液对胃癌BGC－823细胞增殖以及胃癌BGC－823细胞中Bcl－xl基因mRNA表达水平的影响，设计Bcl－xl基因特异性shRNA沉默Bcl－xl基因的表达，从而抑制胃癌BGC－823细胞增殖，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃上皮细胞BGC－823细胞由江苏大学生理教研室提供；东西方型Hp（均为cagA＋菌株）来源于江苏大学附属医院消化科［5］。Hp培养相关材料试剂购于德国 Merck公司；Bcl－xl shRNA Plasmid（h）以及Bcl－xl单克隆抗体购于Santa Cruz Biotechnology，Inc。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 BGC－823于含10%新生小牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2温箱中培养。

1.2.2 Hp培养及菌体超声裂解液的制备 将Hp接种于哥伦比亚固体琼脂培养基，加入10%的新鲜羊血，在微需氧环境，37℃下培养，3d后收集细菌，经鉴定为Hp菌株，然后将Hp刮下后用PBS漂洗2次，悬于不含血清的DMEM培养液中，菌体悬液经超声裂解后浓度调整为（1g／L），－20℃保存备用［6］。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖 取1×103／mL细胞悬液接种于96孔培养板内，待细胞贴壁后吸去培养基，实验组分别加入含10%的东亚型和10%的西方型Hp超声裂解液的培养基，并设置5个平行孔；对照组为不含Hp的裂解液成分培养基，并设置5个平行孔；继续培养24h。参照MTT步骤，于490 nm波长测定吸光度值（OD值）。细胞的增值率（%）＝OD（实验组－对照组）／OD对照组×100%。

1.2.4 荧光定量PCR检测Bcl－xl mRNA水平表达 取1×105／mL细胞悬液接种于6孔培养板内，37℃、5%CO2温箱中培养，待细胞贴壁后，吸去培养基，实验组分别加入含10%的东亚型和10%的西方型Hp超声裂解液的培养基，对照组为不含Hp的裂解液成分培养基，继续培养24h。提取胃癌BGC－823细胞总RNA，证实提取的总RNA可用（图1）。按照逆转录试剂盒说明书，将细胞的总RNA逆转录成cDNA。引物的设计与合成：上游引物 P1：5′－TGG CAG CAG TAA AGC AAG－3′；下游 引物 P2：5′－CAT TTC CGA CTG AAG AGT GA－3′（GenBank登录号：NM＿138578.1），引物由公司合成。引物的长度为137bp。反应体系参照说明书。内参为GAPDH，引物长度为496bp。每个反应至少重复3次。

图1 Hp超声裂解液处理胃癌BGC－823细胞24h后，细胞总RNA的凝胶电泳图

1.2.5 细胞转染 取每毫升3×105细胞悬液接种于6孔培养板内，培养使细胞达到90%～95%的融合。溶液1：在6孔培养板每孔加入无血清DMEM培养基240μL和10μL的脂质体2000（总体积250μL，温育5min）；溶液2：Bcl－xl shRNA Plasmid DNA 2μg溶于250μL的无血清DMEM培养基中；空白照为250μL的无血清DMEM培养基；阴性对照为2μg Control shRNA Plasmid DNA溶于250μL的无血清DMEM培养基中。参照说明书转染。转然后继续培养24～72h检测转染水平。

1.2.6 转染水平检测

1.2.6.1 荧光定量PCR检测Bcl－xl mRNA水平表达 转然后24h，提取细胞总RNA，反转录成cDNA进行荧光定量PCR检测（方法如1.2.4）。

1.2.6.2 蛋白印迹法 提取转染后72h的细胞的总蛋白，蛋白上样量为10μL，将蛋白于Bio－Rad标记的转印仪上转移至PVDF膜上，BSA封闭，Bcl－xl单抗、山羊抗鼠IgG孵育，发光剂孵育5min后于成像系统上扫描，以β－actin为内参，测定其比值。

1.2.6.3 转然后MTT法检测细胞增殖 转染24h后以每孔1×103个细胞接种于96孔培养板，每孔终体积为200μL。培养24h后换液开始实验。分别在24、48h和72h3个时间段测OD。

1.3 统计学处理 用SPSS16.0统计软件进行检验，实验数据均以±s表示。多个均数间比较，采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Hp超声裂解液促进胃癌BGC－823细胞增殖 与对照组相比，东亚型处理组细胞增值率为29.7%（P＜0.01），西方型处理组细胞增值率为18.7%（P＜0.01）；与西方型处理组相比，东亚型处理组细胞增值率为11%（P＜0.01）。见图2。

图2 Hp超声裂解液处理胃癌BGC－823细胞24h后，MTT法检测细胞增殖情况

图3 Hp超声裂解液处理胃癌BGC－823细胞24h后，荧光定量PCR检测细胞中Bcl－xl mRNA水平的表达

图4 Bcl－xl基因RT－PCR后的2%凝胶电泳图

图5 Bcl－xl shRNA转染BGC－823细胞24h后，Bcl－xl mRNA的相对表达量（%）

2.2 Hp超声裂解液可以上调BGC－823细胞中Bcl－xl mRNA水平的表达 与对照组相比，东亚型处理组细胞中Bcl－xl mRNA水平上调了2.39倍（P＜0.01），西方型处理组细胞中Bclxl mRNA水平上调了2.06倍（P＜0.01）；与西方型处理组相比，东亚型处理组细胞中Bcl－xl mRNA水平表达量更高（P＜0.05。见图3、4。

图6 Bcl－xl基因RT－PCR后的2%凝胶电泳图

图7 Bcl－xl shRNA 转染 BGC－823细胞72h后，Bcl－xl蛋白的相对表达量的变化

图8 Bcl－xl shRNA 转染 BGC－823细胞72h后，Bcl－xl蛋白的相对表达量的变化

图9 Bcl－xl shRNA分别转染BGC－823细胞24、48h及72h后，MTT法检测BGC－823细胞的增殖情况

2.3 Bcl－xl shRNA 可以沉默Bcl－xl mRNA、蛋白的表达，并抑制BGC－823细胞的增殖 转染24h后，Bcl－xl mRNA水平明显的下调（图5、6）。转染72h后，Bcl－xl蛋白表达水平也明显下调（图7、8）。转染24、48h和72h后，BGC－823细胞的增殖抑制率分别为7.5%、24.7%、53%（均为P＜0.01），见图9。

3 讨 论

Hp的毒力因子CagA蛋白与胃癌的发生密切相关［7－8］。CagA蛋白主要有东亚型和西方型2种类型。研究显示，东亚型CagA＋Hp与胃癌的发生关系更密切［9］。在本研究中，分别用东亚型和西方型CagA＋Hp超声裂解液处理胃癌BGC－823细胞，与对照组相比，处理组细胞均出现增殖，且东亚型处理组细胞增殖更显著，提示东亚型CagA＋Hp比西方型CagA＋Hp具有更强的生物活性。Bcl－xl是一种抗凋亡基因，在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。在线粒体凋亡途径中，Bcl－xl通过抑制线粒体细胞色素C的释放，从而影响凋亡复合体的组装而发挥抗凋亡作用；在细胞表面的死亡受体介导的凋亡途径中，Bcl－xl通过阻碍死亡复合体（DISC）的组装而发挥抗凋亡作用。Nardone等［10］临床标本研究发现，Hp阳性患者中Bcl－xl基因的表达显著高于 Hp阴性的患者中Bcl－xl基因的表达。Yang等［11］临床标本研究发现，CagA＋Hp患者中Bcl－xl基因的表达显著高于CagA－Hp的患者中Bcl－xl基因的表达。这说明Hp与Bcl－xl基因的表达有一定的相关性，且与CagA毒力因子有关。本研究分别用东亚型和西方型CagA＋Hp超声裂解液处理胃癌BGC－823细胞，与对照组相比，处理组细胞均出现增殖，细胞中Bcl－xl mRNA的表达均出现上调，这提示Bcl－xl与胃癌BGC－823细胞的增殖有一定相关性。RNA干扰技术已广泛应用于肿瘤的治疗研究中［12－13］。许多体外研究也表明，Bcl－xl特异性干扰RNA可以抑制人类肿瘤细胞的增殖［14－15］。因此本研究用Bcl－xl特异性干扰RNA转染胃癌BGC－823细胞，观察其对胃癌BGC－823细胞的增殖的影响。将特异性Bcl－xl shRNA质粒转染胃癌BGC－823细胞，结果胃癌BGC－823细胞中Bcl－xl mRNA的表达以及蛋白的表达均显著降低，并且胃癌BGC－823细胞的增殖作用也有不同程度的降低。这说明胃癌BGC－823细胞的增殖与Bcl－xl基因的表达确有一定相关性。

本研究结果显示，Bcl－xl基因在Hp感染相关性胃癌中扮演着重要的作用，尤其在CagA＋Hp感染相关性胃癌中所起的作用更显著，Bcl－xl特异的干扰RNA可以抑制胃癌shRNA细胞的增殖。因此，Bcl－xl特异的干扰RNA或许可以作为治疗胃癌的方法。

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