刘义德 刘志

ALI/ARDS的主要病理特征是由于肺微血管通透性增高，肺泡渗出富含蛋白质的液体导致肺水肿，进而出现严重低氧血症。蛋白激酶C（PKC）已被证明在急性肺损伤中可被激活，作用于肺微血管内皮细胞的骨架蛋白，引起内皮回缩，细胞间隙增大，是引起血管通透性增加的一条重要途径[1]。Src抑制的蛋白激酶C底物（SSeCKS）是一种新发现的细胞支架蛋白，其相对分子量是280/290kDa，它不仅是PKC的结合底物，而且还是PKC和蛋白激酶A(PKA)的锚定蛋白，是PKC/ PKA的信号传导关键环节。研究发现SSeCKS是一种炎症反应蛋白，参与炎症所致的肺组织和血管内皮细胞的损伤，其表达与炎症的严重程度相关[2]。近年来研究发现长期饮酒是ARDS发病的危险因子，其机制之一是促使炎性因子释放，增强炎症反应。长期饮酒是否引起肺组织SSeCKS的表达改变，目前未见报道，我们通过建立长期饮酒后内、外源性肺损伤动物模型来观察SSeCKS在长期饮酒后肺组织的表达变化及在不同病因导致的肺损伤时是否存在表达差异，为临床治疗急性肺损伤提供新的治疗思路。

1 材料和方法

1.1 实验材料和仪器

1.1.1 动物分组及模型制备：雄性SD大鼠36只，体重210g～250g（中国医科大学实验动物部提供)，饲养环境：温度（23±2）℃，日照时间为12小时光照，分6笼饲养，每笼6只。

1.1.2 长期饮酒模型建立：将大鼠随机分为饮水组和饮酒组，每组18只，按照文献建立长期饮酒模型方法[3]，先适应喂养3天，然后予以6%酒精替代饮水给饮酒组大鼠饮用3天，再换成10%酒精饮用4天，以后予以20%酒精连续饮用5周。饮水组自由饮水，两组饲料均为清洁级全营养颗粒饲料。

1.1.3 肺内外源性肺损伤模型建立：6周后，将饮水组和饮酒组大鼠各随机分成3组，分别是单纯饮水组6只、饮水内源性肺损伤组6只、饮水外源性肺损伤组6只，单纯性饮酒组6只，饮酒内源性肺损伤组6只、饮酒外源性肺损伤组6只。内源性肺损伤组大鼠经称重后予以1%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，经颈正中切口分离气管，用7号针头刺入气管缓慢滴入脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（15mg/kg）；外源性肺损伤大鼠予以LPS（15mg/kg）腹腔注射。

1.1.4 标本采集 给药4小时后，1%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，放血处死大鼠，打开胸腔将双肺完整取出，用冰盐水仔细漂洗，清除上面的血迹，干纱布拭干，保存于-80℃冰箱待检。

1.1.5 实验仪器和主要试剂 高速冷冻离心机（sigma公司），PCR扩增仪(ABI公司)，紫外分光光度计(UV-visible Spectrometer)，Triozol Reagent（Invitrogen公司），引物合成（北京华大基因公司），荧光定量PCR试剂盒（大连宝生物公司），大肠杆菌脂多糖（LPS，sigma公司）。

1.2 操作步骤

1.2.1 Trizol法抽提总RNA。参照Trizol说明书采取一步法提取总RNA。取0.1g肺组织置于1.5毫升离心管中加入Trizol 1ml，在冰浴中迅速匀浆15～30秒充分研碎组织，置于室温中5分钟，后加入0.2ml氯仿摇振15秒，置室温3分钟，4℃离心，12000g×15min。吸取上清液0.5ml加入0.5ml异丙醇摇匀，-20℃置2小时，4℃离心12000g×15min。弃上清，加75%乙醇1ml，4℃离心，7500g×15min。弃上清，加Nuclease free water 15μl。采用紫外可见光分光光度计测定260nm、280nm OD值，样品-80℃ 保存备用。

1.2.2 RNA浓度和纯度测定。取1μl RNA样本，加79μl DEPC水，紫外分光光度计测OD260与OD280，二者比值应1.8～2.0，提示样本中RNA纯度合格。RNA(μg/μl)浓度＝OD260×40×稀释倍数/1000。

1.2.3 逆转录合成cDNA。将2μlRNA加入到逆转录体系中合成cDNA，反应体系为20μl，其中PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μl、5×PrimeScript Buffer 4μl、Random 6 mers（100μM）1μl、Oligo dT Primer（50μM）1μl。Rnase Free dH2O 11μl。反应条件为：37℃15min，85℃5s。

1.2.4 引物的设计与合成。用于PCR的大鼠SSeCKS和内参GAPDH的引物均由北京华大基因公司合成。根据GenBank提供的SSeCKS基因序列（AY695056)设计上游引物为5’-AAGTGCTGGCTTCGGAGAAAG-3’(3106 3126)，下游引物为5’-TGACTTCAGGAACTT CAAGGCTC-3’(3215 3237)，内参GAPDH 序列为上游引物5’-GCAAGTTCAACGGCACA-3’,下游引物5’-CATTTGATGTTAGCGGGAT-3’。

1.2.5 PCR扩增。 PCR按照说明在ABI PRISM7500序列检测系统中进行，对cDNA样本进行双份检测以减小误差。数据按2-△△CT法计算，结果以相对于GAPDH的倍数来表示。

1.3 统计学方法

用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，数据用均数±标准差±s)表示，各组均数的比较行单因素方差分析，用最小显著差法(1east significant difference，LSD)作两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 饮水和饮酒各组肺组织SSeCKSmRNA表达变化

图2 饮水各组肺组织SSeCKSmRNA表达变化

图3 饮酒各组肺组织SSeCKSmRNA表达变化

2 结果

单纯饮酒组肺组织SSeCKSmRNA表达较饮水组增多（P＜0.05），肺损伤各组肺组织SSeCKSmRNA表达较饮水组增多（P＜0.01），饮酒内、外源性肺损伤各组较饮水内、外源性肺损伤各组增多显著（P＜0.05），饮酒内、外源性肺损伤组之间表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1～3。

3 讨论

SSeCKS是于1995年被Lin等在NIH3T3细胞中发现一种PKC的底物，其氨基端内豆蔻酰化，辅助其与细胞质膜结合，二级结构呈杆状，富含丙氨酸、赖氨酸、丝氨酸和谷氨酸基，是一种热稳定蛋白[4]。人与大鼠SSeCKS的DNA序列有高度的同源性。

在实验中发现长期饮酒大鼠肺组织的SSeCKS表达较单纯饮水大鼠有所增加。导致这一结果可能的机制为酒精的主要代谢产物乙醛可升高大鼠血清中AngⅡ的水平。当AngⅡ作用于血管平滑肌细胞后，SSeCKSmRNA水平有明显升高，并通过细胞内信号传导机制参与了细胞支架和细胞外基质的重构，改变了血管的通透性[5]。增加了肺损伤的易感性。

SSeCKS是一种炎症反应蛋白，腹腔注射LPS后，可观察到肺脏、心脏、肝脏、等组织的内皮细胞SSeCKS mRNA表达增加，其中肺组织表达最为明显[6]，研究表明SSeCKS在肺组织中定位于肺微血管内皮细胞（PMVEC）[7]。PMVEC是炎症反应的重要反应细胞。当受到炎症刺激时可激活PKC，作用于骨架蛋白，引起内皮细胞的回缩，细胞间的粘附体变弱，甚至消失而间隙增大，使血管通透性增加[8]。SSeCKS作为细胞支架蛋白，既是PKC的结合蛋白又是PKC作用的底物，在细胞骨架重构、细胞分化和运动过程中起到很重要作用[9]。本实验显示SSeCKSmRNA在损伤各组肺组织中表达均明显增加，同其他研究结果相一致。饮酒损伤各组增加较饮水损伤各组更加显著。提示长期饮酒损伤组由于受到AngⅡ及LPS双重刺激使SSeCKS表达进一步增加。外源性肺损伤组SSeCKSmRA表达有高于内源性肺损伤组趋势，但无统计学意义。由于SSeCKS定位于肺微血管内皮细胞，因此，外源性肺损伤时其表达更为明显。同时SSeCKS当受到LPS诱导时表达具有时间依赖性[10]，所以本实验内、外源组表达未见统计学差异，考虑可能与所选取的时间点有关，需进一步深入研究。

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[6]Kitamura H, Okita K, Fujikura D, et al. Induction of Srcsuppressed C kinase substrate (SSeCKS) in vascular endothelial cells by bacterial lipopolysaccharide[J]. J Histochem Cytochem, 2002, 50:245-255.

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[8]Tinsley JH, Breslin JW, Teasdale NR, et al. PKC-dependent,burn-induced adherens junction reorgnization and barrier dysfunction in pulmonary microvascular endothelial cells[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physio1, 2005, 289: L217-L223.

[9]Rung-ruangkijkrai T, Fujikura D, Kitamura H, et al. The expression of src-suppressed C kinase substrate (SSeCKS) and uptake of exogenous particles in endothelial and reticular cells[J]. Arch Histol cytol,2004,67:135-147.

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