侯仲杰，王靖飞，付朝阳，高宏雷，高玉龙，祁小乐，郭莹莹，王笑梅

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001)

传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)分为致病性血清Ⅰ型和非致病性血清Ⅱ型，致病性IBDV主要侵害雏鸡的法氏囊从而导致严重的免疫抑制，给家禽养殖业造成严重损失[1]。IBDV基因组由A和B两个双链RNA片段组成[2-3]，A片段包含两个部分重叠的开放阅读框(ORF)，大ORF编码分子量约为110ku的前体多聚蛋白(NH2-pVP2-VP4-VP3-COOH)[4]，其中 VP2被证明与IBDV毒力密切相关[5-6]，但也有研究表明VP2并非毒力决定的唯一因素，VP3、VP4蛋白对病毒毒力和致病力也有影响[7-9]。

与单纯的多序列比对以及构建进化树等生物信息学技术相比，进化踪迹分析技术对分析数量较多、但功能位点尚不明确的序列具有优势，并被应用于多种病毒的氨基酸特异位点的分析[10-13]。在IBDV毒力变异研究领域尚未有研究者利用该方法进行分析研究。本实验利用进化踪迹分析技术对GenBank中登录的28条IBDV基因组A节段编码的前体蛋白全长序列进行分析，获得与IBDV毒力变异相关的特异性氨基酸及其位点，为研究影响IBDV毒力变异的细胞生物学和分子生物学特征提供参考。

1 材料和方法

1.1 IBDV基因组A节段编码的前体多聚蛋白序列本实验中28条不同毒力IBDV基因组A节段编码的前体多聚蛋白序列均来源于GenBank数据库，所有病毒株均为毒力、来源等生物学背景明确的参考病毒株(表 1)。

1.2 前体多聚蛋白的多序列比对和进化树的构建采用ClustalW 1.83软件进行多序列比对，并将比对结果提交到剑桥大学ET服务器构建遗传踪迹树状图[14]。ClustalW 1.83的参数设置为Gap Opening：10；Gap Extension：0.20；Delay DivergentSequences：30%；DNA Transition Weight：0.50；Use Negative Matrix：OFF； DNA Weight Matrix： IUB； Protein Weight Matrix：Gonnet series。

2 结果

2.1 致病性与非致病性IBDV氨基酸残基及其位点分析 将28个IBDV前体多聚蛋白氨基酸序列的多序列比对结果提交至剑桥大学的生物信息学数据处理器构建进化踪迹树状图(图1)。表2更为直观地显示了不同毒力特征的病毒株分组情况。P02～P10的分组情况相同，分为两个组，第一组包含非致病IBDV，OH和23/82；第二组包含所有的致病IBDV。值得注意的是，以色列的致弱病毒株Mb与超强病毒株Ks同分在P15内，显示Mb与Ks的相似性高，表明影响其毒力变异的位点可能存在于基因组密码子或者其它结构蛋白中。

表1 前体多聚蛋白的背景信息Fig.1Background information of the precursor protein

表2 序列分组(一个节点包含的所有分支为同一组)Fig.2Classification of the sequences(Every node including its child branches forms one class)

在P10中，非致病性血清Ⅱ型与致病性血清Ⅰ型IBDV，各分为一组。踪迹残基显示了两血清型的组保守氨基酸位点，这些位点可能影响IBDV致病性与否(图2)。P10显示IBDV组保守氨基酸位点(X状符号)共有83个(图2)，其中在第1位～452位氨基酸之间分布47个；在第453位～722位氨基酸之间共有21个；余下的氨基酸序列内含有15个。表明氨基酸变异主要集中于VP2蛋白，约占该区氨基酸总数的10.40%；VP4次之，约占7.78%；VP3蛋白的变异程度最小，约为5.17%。实验结果进一步表明VP2对IBDV毒力变异的重要性。推断由于VP2为IBDV外壳蛋白的主要组成部分并且位于最外层，IBDV最可能通过该蛋白接触宿主细胞，因此VP2蛋白的氨基酸变异对病毒侵染宿主靶细胞过程至关重要，是影响IBDV细胞嗜性和毒力差异的主要因素。

2.2 不同毒力IBDV保守氨基酸残基分析 P12中包含超强病毒株、致弱病毒株和经典病毒株。在这里3号～26号病毒株并未因为毒力差异而区分开，所以P12的氨基酸残基无法作为毒力差异判断的依据。但值得注意的是，通常被认为与毒力变异有关的7肽区含有6个保守氨基酸残基，分别为326S、327W、328S、329A、331G和332S。这6个氨基酸甚至在P13～P15均为保守的，表明本实验分析的病毒株的毒力差异并未表现在7肽区的这6个氨基酸上。

P13包含两个分组：第一组(3～16)均为超强病毒株，第二组(19～26)，包括致弱病毒株和经典病毒株。与P12相比P13少了韩国的两株超强病毒株KK1和KSH。因此，在P13内包含超强毒病毒株的保守氨基酸位点。由图2可见294I、299S、451L、680Y、715S和751D为超强病毒株的组保守位点，而致弱病毒株和经典病毒株在相应位置则为294L、299N、451I、680C、715P和751H。这些位点中有3个位于VP2蛋白，两个位于VP4蛋白，一个位于VP3蛋白，其中451位点、715位点和751位点分别毗邻 VP2-VP4、VP4-VP3切割位置，表明该点的突变对VP2和VP4的加工过程可能有一定的影响，从而导致病毒在宿主细胞内复制速率的改变进而改变病毒毒力。

P14含有3个分组，第一个分组几乎均为超强病毒株，第二个分组为致弱病毒株，第三个分组为经典病毒株。P15含有3～12、19～23两个分组，第一组内除以色列的Mb为减毒株外其余则为超强病毒株，第二组均为致弱病毒株，可以认为组保守氨基酸残基与P14相同。在P14中所有的病毒株可以根据毒力差异完全区分开，从而可以发现组保守氨基酸残基，这些位点则为可能影响IBDV毒力变异的氨基酸位点。在P14中显示：242、253、294、299、330、451、680、715、751和981共10个组保守氨基酸位点，其中超强病毒株为242I、253Q、294I、299S、330S、451L、680Y、715S、751D和981P；致弱病毒株为242Y、253H、294L、299N、330R、451I、680C、715P、751H和981L；经典病毒株为242I、253Q、294L、299N、330S、451I、680C、715P、751H和981P(图2)。超强病毒株与经典病毒株的差异位点表现在氨基酸序列的299位、451位、680位、715位和751位；致弱病毒株与经典病毒株的差异位点在氨基酸序列的242位、253位、330位和981位；超强病毒株与致弱病毒株的差异位点在这10个位点均不相同。表明IBDV毒力差异并非由单一氨基酸突变引起，而是多位点氨基酸突变共同引起的，这与目前IBDV毒力变异研究领域发表的实验结论一致。

3 讨论

传染性法氏囊病是一种危害幼龄鸡的急性、高度接触性传染病。多年来，传染性法氏囊病在鸡群中广泛流行，尤其是近10年来越来越严重。由于IBDV的变异株和超强病毒株的出现，给养禽业造成严重的经济损失。近几年，我国多数IBDV流行病毒株的毒力均已超过标准IBDV，而接近超强病毒株。病毒毒力和致病力的大小主要取决于病毒主要组成蛋白氨基酸的序列。为研究病毒的氨基酸序列与其致病性的关系，本研究选取了28个毒力不同的参考病毒株，比较它们外膜蛋白VP2所在的A片段前体蛋白基因序列，从而寻找导致毒力变异的氨基酸残基位点。

本研究结果显示毒力特征性保守氨基酸残基多集中在VP2蛋白，由于VP2为IBDV的主要结构蛋白，所以它的突变可能对细胞嗜性和毒力的变异具有一定影响。同时在VP2-VP4、VP4-VP3切割位点附近的突变氨基酸也不能忽视，因为它们可能通过作用于前体多聚蛋白的加工过程来改变病毒在宿主细胞复制速率从而导致IBDV毒力的强弱。

综上所述，我们利用进化踪迹分析技术对IBDV基因组A节段编码的前体多聚蛋白序列进行了分析，阐述了可能影响IBDV毒力变异的氨基酸及其位点，为进一步研究IBDV的精细结构与功能提供了依据，同时为设计靶向不同病毒株的药物和细胞受体研究奠定基础。

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