李 冰，李慧昕，王 钰，韩宗玺，邵昱昊，刘小丽，孔宪刚

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室/兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001)

鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis，DVE)是由鸭肠炎病毒(DEV)引起的鸭、鹅及多种雁型目禽类的一种急性、败血性传染病。该病于1923年首次在荷兰报道[1]，后陆续在多个国家均有报道，1967年至1995年间，美国多个州爆发鸭病毒性肠炎疫情[2]。我国于1957年由黄引贤首次报道该病[3]，该病多发生于养鸭业较发达的地区，给养鸭业造成重大的经济损失[4]。

DEV为疱疹病毒科成员[5]，基因组为双股线性DNA。DEV粒子具有疱疹病毒的典型特征[6]，其囊膜糖蛋白主要包括 gB、gC、gD、gE、gH、gI、gK、gL、gM、gN和gJ。目前已知疱疹病毒侵入细胞至少需要4种糖蛋白的参与，即gB、gD、gH及gL。首先，gD作为受体结合蛋白，与宿主细胞膜上的受体相结合，激活膜融合系统，随后由gB和gH/gL二聚体执行膜融合功能[7]。gL蛋白必须与gH蛋白形成二聚体才能发挥其膜融合功能，在病毒的入侵及细胞与细胞间感染中，gL蛋白能够促进gH蛋白在感染细胞内进行正确折叠并转运至细胞膜表面[8]。有研究表明，这两种蛋白的共表达能够刺激机体产生中和抗体[9]，在诱导机体产生免疫应答作为保护性免疫方面也起到重要作用[10]。

本研究对DEV gL蛋白进行原核表达并制备抗血清，检测gL蛋白在病毒复制过程中的动态表达情况，为其生物学功能的研究奠定基础，同时也为进一步研究gL蛋白在DEV侵染过程中的功能提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 DEV Clone-03株和293T细胞由本研究室保存；E.coli感受态细胞TG1、BL21(DE3)及鸡胚成纤维原代细胞(CEF)由本研究室制备；pMD18-T购自TaKaRa公司，pET-30a和pcDNA3.1(+)购自Novagen公司。

1.2 酶类及主要生化试剂 T4DNA连接酶、Ex Taq DNA聚合酶和各种限制性内切酶购于TaKaRa公司；基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购于Axygen公司；ProBondTMPurification System纯化试剂盒购自Invitrogen公司；转染试剂Fermentas TurboFect购于MBI公司；羊抗鼠IgG-HRP、羊抗鼠IgG-FITC及弗氏佐剂购于Sigma公司。

1.3 实验动物 9日龄SPF鸡胚和8周龄雌性BALB/c小鼠由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.4 引物设计 根据GenBank中登录的DEV Clone-03UL1基因序列(NC_013036)设计引物。原核表达引物，L1t：5'-GGATCCGAAACTTCCTGTAGT TACCC-3'(Bam HⅠ)和 L2：5'-CACCATGGCCGACG ATAGGAATTC-3'(EcoRⅠ)。真核表达引物L1：5'-GGATCCATGGGTTCCAGATGGAAG-3'(Bam HⅠ)和L2：5'-CACCATGGCCGACGATAGGAATTC-3'(EcoRⅠ)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.5 目的基因的扩增及重组质粒的构建 以DEV Clone-03基因组DNA为模板，用引物L1t和L2扩增gLt(181bp～711bp)基因片段；以引物L1和L2扩增gL(1bp～711bp)基因片段。PCR反应程序为：95℃ 5m in；95℃ 50s、55℃ 50s、72℃ 1m in，30个循环；72℃7min。切胶回收目的片段，将目的片段分别克隆至pMD18-T载体，转化至感受态细胞TG1。经PCR和序列测定鉴定，通过Bam HⅠ和EcoRⅠ对其进行双酶切，分别亚克隆至以相同酶切处理的原核pET-30a和真核pcDNA3.1(+)表达载体中，转化至TG 1感受态细胞中。提取重组质粒，经酶切鉴定及序列测定，重组质粒分别命名为pET-gLt和 pcDNA-gL。

1.6 gLt重组蛋白的表达及纯化 pET-gLt转化至BL21(DE3)感受态细胞，经终浓度为0.6mM的IPTG诱导培养4h，经12%SDS-PAGE电泳分析表达情况。重组菌以7M盐酸胍进行裂解，经超声破碎后离心收集上清。应用ProBondTMPurification System纯化系统进行蛋白纯化(按照说明书操作)。采用0.01M PB缓冲液对纯化后的gLt重组蛋白进行透析及PEG6000对重组蛋白进行浓缩，紫外吸收法测定蛋白浓度。

1.7 鼠抗gLt抗体的制备 将重组蛋白免疫8周龄BALB/c小鼠进行抗体制备，免疫剂量为100μg/只。首次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，每两周加强免疫一次，共免疫3次。末次免疫后7d，对小鼠进行眼球采血，分离抗gLt血清。

1.8 gL蛋白的真核表达检测 采用Fermentas TurboFect转染试剂，将pcDNA-gL转染至单层的293T细胞(按说明书操作)。收集转染后6h～72h的293T细胞，进行western blot检测[11]。以制备的鼠抗gLt抗体为一抗(1:300)，以羊抗鼠IgG-HRP(1:5000)为二抗，通过3，3'-二胺基联苯胺(DAB)显色进行western blot检测。

1.9 gL在病毒感染CEF中表达的检测

1.9.1gL表达的间接免疫荧光(IFA)检测以0.001MOIDEV接种CEF单层，在感染后6h～72h进行检测。将感染DEV的CEF用4%多聚甲醛固定，以制备的鼠抗 gLt抗体(1∶300)为一抗，以羊抗鼠IgG-FITC(1∶80)为二抗，荧光显微镜观察结果。

1.9.2gL表达的western blot检测以0.001MOI DEV接种CEF单层，在感染后6h～72h收集细胞，同时设未感染DEV的CEF作为阴性对照。以制备的鼠抗 gLt抗体为一抗(1∶300)，以羊抗鼠IgG-HRP(1∶5000)为二抗，通过DAB显色。

2 结果

2.1 目的基因的PCR扩增结果 以DEV Clone-03基因组为模板，用引物L1t和L2、L1和L2分别扩增出约500bp和700bp左右的片段，序列测定结果表明，gLt基因片段为543bp，gL基因为711bp(图1)。

2.2 gLt重组蛋白的表达及纯化 将构建的重组质粒pET-gLt转化BL21(DE3)感受态细胞，经0.6mM IPTG诱导4h。经SDS-PAGE检测结果表明，gLt重组蛋白获得了大量表达，其分子量约为27ku，而未诱导重组菌无明显的目的蛋白条带。纯化并复性后的重组蛋白经SDS-PAGE电泳分析，结果显示为一条单一的蛋白条带(图2)。

2.3 gL蛋白真核表达检测 将pcDNA-gL转染293T细胞，经western blot检测结果显示，转染后12h能够检测到gL蛋白少量表达，转染后24h检测到gL蛋白明显表达，随着转染时间增加gL表达量增加，转染后72h gL蛋白表达量最高。检测的gL蛋白大小约为20ku。而转染空载体的293T细胞以及未转染的293T细胞则未检测到相应的蛋白条带(图 3)。

2.4在DEV复制过程中gL蛋白表达检测 将DEV感染CEF，IFA检测结果表明，其感染后6h和12h时未检测到gL蛋白的表达，在24h时可在CEF中检测到gL蛋白的表达，48h和72h能够检测到gL蛋白的明显表达，随着时间的增长gL蛋白的表达量增加(图4)。

Western blot检测结果显示，DEV感染6h、12h和24h后，均未检测到gL蛋白的表达；直到48h开始检测到gL蛋白明显的表达，在感染后72h，gL表达量增加；gL蛋白分子量大小约为20ku，与gL在真核表达中检测到的蛋白条带大小相符(图5)。

4 讨论

DEV gL蛋白由UL1基因编码，ORF全长711个核苷酸，编码由236个氨基酸残基组成[11]，其非糖基化状态分子质量约为26.22ku。在疱疹病毒成员中，UL1基因的编码的氨基酸序列相对保守，但在核苷酸序列上差异较大[12]。目前，以HSV-1各蛋白功能研究较为深入，已有报道，HSV-1gL蛋白与gH蛋白以异源二聚体的形式发挥功能，成熟的gL蛋白没有跨膜区，但具有可裂解的信号肽。gL蛋白是一种I型糖蛋白，与gH蛋白共表达并锚定于细胞膜上；而且，gH需要gL辅助进行正确加工、折叠及转运到内质网膜上[13]。

本研究曾试图对DEV gL基因全长进行原核表达，但是未获得成功。利用Signal P 3.0在线分析软件分析DEV gL蛋白，结果表明gL蛋白是膜锚定蛋白，Cys64-Ser65位氨基酸是其信号肽裂解位点，因此本研究在对gL蛋白进行原核表达时将gL蛋白N末端60个氨基酸截掉，获得了分子量约为27ku的重组蛋白，这与预期大小为20ku蛋白有些差异，分析出现差异的原因可能为原核表达载体pET-30a携带6His-tag。已有研究表明，组蛋白含量多的肽链具有异常高的正电荷，在进行SDS-PAGE时，组蛋白所带的正电荷不能被结合的SDS所带的负电荷覆盖，导致其迁移率变慢，从而使其表观分子质量大于实际分子质量[14]。

为了探讨gL蛋白在病毒复制过程中表达情况，本研究利用制备的鼠抗gL蛋白抗体检测DEV感染CEF后gL蛋白的表达情况。在DEV感染的早期即感染后6h和12h均未能够检测到gL蛋白的表达，在DEV感染后24h，应用IFA方法检测到了该蛋白的表达，由于此时gL蛋白表达量较小，western blot未检测到其表达。将gL转染293T细胞后12h，western blot即检测到gL蛋白的表达，而DEV感染CEF后48h才能检测到gL蛋白的表达，表明编码gL蛋白基因可能是病毒复制的晚期表达基因，其表达受病毒其它基因的调控，这有待于进一步研究。Western blot检测病毒感染细胞后表达成熟的gL蛋白分子量大小约为20ku，与预期的26ku不符。由于DEV gL蛋白在Cys64-Ser65位氨基酸有裂解位点，成熟的gL其N末端的膜锚定序列被剪切掉形成成熟的蛋白，因此出现与预期大小有差异，这与HSV-1及PRV中的gL蛋白相似[15-16]。

本研究通过制备鼠抗gLt抗血清对gL蛋白在感染DEV的CEF中动态表达情况进行检测，为进一步研究gL蛋白在DEV侵染及复制中的功能及其与gH蛋白之间的相互作用奠定基础。

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