姜一峰，周艳君，王亚欣，朱建平，徐彦召，童 武，虞凌雪，童光志

(中国农业科学院上海兽医研究所猪病研究室，上海200241)

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory virus，PRRSV)属于尼多病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，属单股正链RNA病毒[1]。基因组全长约15kb，5'端有帽子结构，3'端有polyA尾，病毒非结构蛋白编码区靠近5'端，占基因组全长约4/5，病毒结构蛋白编码区靠近3'端，部分结构蛋白基因首尾有部分重叠[2]。

PRRSV有9个开放阅读框(ORF)，分别为ORF1a、 ORF1b、 ORF2、 ORF2a、 ORF3、 ORF4、ORF5、 ORF6、 ORF7， 分 别 编 码 pp1ab、 pp1a、GP2、E、GP3、GP4、GP5、M、N蛋白[1-3]。最近的研究显示，在ORF4与ORF5上存在一个新的ORF，命名为ORF5a，编码新发现的结构蛋白GP5a[4-5]。ORF1a，ORF1b编码病毒的非结构蛋白，ORF2-7编码病毒结构蛋白。

2006 年，我国猪群中出现了一种变异的PRRSV，与经典的PRRSV相比毒力显著增强[6]，将该高致病性PRRSV(HP-PRRSV)在体外多次传代后毒力显著下降，而且对猪不致病[7]。本实验以HP-PRRSV强毒HuN4-F5及其体外传代致弱病毒HuN4-F112的感染性分子克隆为基础，将ORF1a，ORF1b，ORF2-73个大片段在强弱毒之间进行相互替换，以研究ORF1a，ORF1b，ORF2-7对病毒生物学特性的影响。

1 材料和方法

1.1 病毒株、细胞及主要试剂 HP-PRRSV HuN4-F5株及其弱毒HuN4-F112株感染性分子克隆由本实验室构建[8-9]；BHK-21、Marc-145细胞由本实验室保存；羊抗鼠FITC荧光标记的IgG(FITC-TgG)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；转染试剂DMRIE-CReagent购自Invitrogen；DMEM、Opti-MEM培养基购自GIBCO公司；体外转录试剂盒mMessage High Yield Capped RNA Transcription kit购自Ambion公司；PRRSV阳性血清由本实验室制备保存；DL2000DNA Marker购自TaKaRa公司。

1.2 嵌合病毒的构建策略 HuN4-F5和HuN4-F112全病毒基因组分别被克隆在质粒pBluescriptⅡSK(+)中，选择PacⅠ(位于质粒上)和AscⅠ酶切位点作为强弱毒ORF1a互换所用酶切位点，NheⅠ和AscⅠ作为强弱毒ORF1b互换所用酶切位点，AscⅠ和NotⅠ(位于质粒上)作为强弱毒ORF2-7互换所用酶切位点(图 1)。……