潘爱珍，赵秀芹，张媛媛，王晓萌，柳正卫，万康林

2.浙江省疾病预防控制中心，杭州 310051

近年来，结核病耐药问题已成为全球公共卫生关注的焦点，尤其是耐多药和广泛耐药。异烟肼作为常用的一线抗结核药物，对病人的治疗发挥重要作用。全球范围内，异烟肼总耐药率13.3%，初治结核病例耐药率10.3%，复治病例耐药率27.7%；在我国，异烟肼总耐药率18.96%，初治结核病例耐药率16.01%，复治病例耐药率38.51%，各项均高于全球水平［1］。因此对异烟肼耐药性快速诊断很有必要。

研究表明，结核分枝杆菌异烟肼耐药性的产生与katG、inh A、kasA、ahp C和ndh等多基因的突变相关［2］，但60%～70%的耐药株是由于katG基因第315位密码子突变所致［3］，且这一突变与高耐药量密切相关［4］。因此，katG基因是异烟肼耐药性检测的首选基因。本研究的目的是针对常见异烟肼耐药位点katG315建立Taq Man－MGB荧光定量PCR技术，以达到快速诊断结核分枝杆菌异烟肼耐药，为临床提供及时有效的化疗指导。

1 材料与方法

1.1 阳性对照标准株 FAM－MGB野生型阳性标准菌株H37Rv，购自中国药品生物制品检定所。HEX－MGB突变型阳性标准菌株FJ07063，katG315 G→C，背景明确且稳定的菌株。由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核病室传代培养、保藏。

1.2 实验菌株 130株结核分枝杆菌临床分离株均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核病室提供，包括71株结核分枝杆菌临床分离株katG315位点测序结果为野生型G，57株315位密码子G→C，2株315位密码子G→A。

1.3 16株非结核分枝杆菌标准株 鸟分枝杆菌95001、胞内分枝杆菌95002、蟾分枝杆菌95003、施氏分枝杆菌95008、堪萨斯分枝杆菌95013、海分枝杆菌95014、猿分枝杆菌95015、瘰疬分枝杆菌95017、戈登分枝杆菌95018、龟分枝杆菌95020、脓肿分枝杆菌95021、偶发分枝杆菌95022、耻垢分枝杆菌95023、东海分枝杆菌95038、灰尘分枝杆菌95040、南非分枝杆菌95044。均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核病室传代培养、保藏。

1.4 7种常见呼吸道感染细菌的标准株核酸提取物 金黄色葡萄菌株、肺炎链球菌、肺炎克雷伯、肺炎衣原体、百日咳、化脓链球菌、肺炎支原体，分别由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所呼吸道室、诊断室提供。

1.5 主要仪器与试剂 荧光Line－Gene K、DNA自动扩增仪，杭州博日科技有限公司；凝胶成像系统，英国 Uvi公司。TIANprep Mini Plasmid kit（质粒提取试剂盒）、TIANgel Mini Purification kit（胶回收试剂盒），天根生物工程公司；p MD18－T载体、感受态细胞E.coliJM109，Ta KaRa公司。BioEasy Taq Man PCR Magic Mix，杭州博日科技公司。

1.6 结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌菌株DNA的提取，方法见文献［5］。

1.7 引物和探针 根据katG315突变位点设计引物和特异性探针，见表1。引物和探针由上海基康生物技术有限公司合成。

表1 引物和探针序列Tab.1 Primers and probes sequences

1.8 荧光PCR条件参数优化katG基因单通道或双通道Taq Man实时PCR实验参数的优化主要包括上下游引物浓度的优化、探针浓度和退火温度的优化。用H37Rv和FJ07063优化荧光PCR体系。根据CT值和荧光值并结合节省试剂的原则来判断优化的条件。

1.9 PCR体系和条件 常规PCR体系（40μL）：上下游引物（10μmol/L）各1.5μL，Pre－mix 20μL，去离子水15μL，模板2μL。循环参数为94℃ 预变性2 min；94℃变性30 s，退火60℃30 s，延伸72℃30 s，共35个循环；72℃延伸5 min。双通道荧光PCR体系（20μL）：Taq Man PCR－mix 10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.8μL，双探针（10μmol/L）各0.4μL，Taq polymerase 0.15μL，去离子水5.45μL，模板2μL。循环参数为94℃ 预变性2 min；94℃变性10 s，退火60℃40 s，共40个循环；在60℃退火温度时收集荧光信号。产物于2%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察结果。

1.10 阳性标准品的构建和标准曲线的制备 常规PCR反应体系和条件分别扩增H37Rv和FJ07063。PCR产物胶回收后克隆入p MD18－T载体转化到感受态细胞EcoliJM109内。抽提质粒并进行验证，经浓度测定和拷贝数换算，进一步稀释阳性标准品制备标准曲线。

1.11 特异性检测 荧光PCR检测16种非结核分枝杆菌的标准株和7种常见呼吸道感染细菌的标准株核酸提取物，评价方法的特异性。

1.12 最低检测下限检测 荧光PCR与常规PCR法分别扩增10倍稀释梯度阳性标准品作最低检测下限比较

1.13 稳定性检测 用标准品 H37Rv（1.0×106copies/μL）分两批隔两天连续进行10次荧光PCR反应扩增，观察批内和批间CT值变化以检测其稳定性。同时对H37Rv不同拷贝数标准品 （1.0×107copies/μL、1.0×105copies/μL、1.0×103copies/μL）进行荧光PCR反应扩增，每种浓度作双孔平行检测，观察其CT值变化以检测其稳定性。

1.14 质量控制和诊断标准 每次扩增均以H37Rv，FJ07063作为阳性对照，以双蒸水代替模板为阴性对照。CT≤37，有典型荧光S型曲线为阳性，CT＞37为阴性。所有菌株都设有双孔平行检测。

2 结 果

2.1katG基因单通道Taq Man实时PCR实验参数的优化。

2.1.1 引物浓度的优化 先将探针浓度固定在200 nmol/L，退火温度60℃，选择引物终浓度在100～800 nmol/L之间优化，根据CT值小、荧光信号较强并结合节省试剂的原则，确定最佳引物浓度FAM 通道为400 nmol/L，HEX通道为500 nmol/L，见表2。

表2 不同引物浓度下FAM、HEX单通道的CT值Tab.2 FAM，HEX single channel CT value in different primer concentration

2.1.2 探针浓度优化 根据2.1.1的结果，引物浓度FAM通道固定在400 nmol/L，HEX通道固定在500 nmol/L，退火温度60℃，选择探针终浓度在100～400 nmol/L之间优化，根据优化原则，确定最佳探针浓度FAM通道为200 nmol/L，HEX通道为300 nmol/L，见表3。

表3 不同探针浓度下FAM、HEX单通道的CT值Tab.3 FAM and HEX single channel CT value in different probe concentration

2.1.3 单通道退火温度优化 根据2.1.1和2.1.2的结果，固定引物和探针浓度，退火温度从54℃～64℃以2℃上升梯度优化，最后确定最佳退火温度为58℃。

2.2katG基因双通道Taq Man实时PCR实验参数的优化

2.2.1 双通道引物和探针优化 考虑到双通道两种探针相互干扰的可能性，按照单通道优化的结果通过3种方案来优化双通道引物和探针参数，见表4。最终确定上游引物终浓度400 nmol/L，下游引物终浓度400 nmol/L，探针P1终浓度200 nmol/L，探针P2终浓度200 nmol/L。

A：F、R：450Nm，PW、PM：250Nm；B：F、R：450Nm，PW：200 Nm，PM：300Nm；C：F、R：400 Nm，PW、PM：200Nm；＊为优化值

2.2.2 双通道退火温度优化 在2.2.1优化基础上，退火温度从56℃～62℃以2℃上升梯度优化，最终确定60℃为退火温度。

2.3 制备阳性标准品

2.3.1 阳性克隆子验证 对挑选出的克隆子进行常规PCR扩增，均得到目的基因片段122 bp，证明是阳性克隆子，见图1。PCR鉴定阳性后，对提取的克隆质粒测序，经与已知目的序列进行BLAST比较，证明重组质粒序列正确。

2.3.2 质粒拷贝数的计算以及质粒的倍比稀释质粒H37Rv和FJ07063的DNA做3次浓度测定平均值分别为47.6 ng/μL，78.8 ng/μL，换算为拷贝数分别为：1.5×1010copies/μL，2.6×1010copies/μL。用双蒸水将上述质粒依次稀释成1.0×1010copies/μL－1.0×100copies/μL共11个浓度梯度备用。其中1.0×107copies/μL－1.0×100copies/μL作8个梯度用于做标准曲线。质粒H37Rv和FJ07063的1.0×106copies/μL作为平时检测菌株的阳性对照。

2.4 最低检测下限

2.4.1 荧光PCR双通道最低检测下限 用梯度稀释的标准品H37Rv和FJ07063作标准曲线，得知FAM、HEX最低检测下限为10 copies/μL。双通道FAM最低检测下限对应的CT值为35（见图2），HEX为37（见图3）。反应体系中标准品拷贝数的对数与相对应的扩增CT值存在一定的线性关系，说明两者线性相关性好，实验结果可信，系统误差较小。

2.4.2 常规PCR最低检测下限 用相同的引物按照常规PCR的条件和体系扩增以上梯度稀释的标准品，得到目的片段，见图4。常规PCR最低检测下限为1.0×104copies/μL。

图1 克隆子扩增结果Fig.1 Amplified products of the clones by PCR M：100bp marker；1：H 37 Rv positive control；2：FJ07063 positive control；3：negative control；4：H 37 Rv clone；5：FJ07063 clone

2.5 特异性 荧光PCR检测16种非结核分枝杆菌和7种常见呼吸道感染细菌，23株菌株双通道都未出现阳性，探针的特异性100%。

2.6 荧光PCR检测临床分离株

2.6.1 130株菌株荧光PCR扩增结果 130株菌株双通道荧光PCR扩增，野生型探针检测到71株，突变型探针检测到57株。有2株菌株双探针均为阴性。

2.6.2 实验菌株荧光PCR结果与DNA测序分析比较katG315位点测序结果为G的71株菌株和该位点测序结果为C的57株菌株经荧光PCR分别被野生型和突变型探针准确检测出，因此无论哪种探针的敏感性和特异性均为100%，阳性预测值和阴性预测值均为100%。其中该位点测序结果为A的2株菌株，野生型和突变型探针均未检测到。

2.7 荧光PCR体系的稳定性

2.7.1 批内和批间的稳定性 对 H37Rv 1.0×106copies/μL分两批隔两天连续进行10次荧光PCR反应，2次批内和1次批间CT值的标准差分别是0.11，0.15，0.14，变异系数为 0.55%，0.76%，0.71%，变异系数小于1%。见表5。

表5 批内和批间CT值比较Tab.5 Comparison of the CT value among Intra and inter test groups

2.7.2 不同浓度的稳定性 对H37Rv不同拷贝数标准品（1.0×107copies/μL、1.0×105copies/μL、1.0×103copies/μL）分别进行荧光PCR反应扩增，每种浓度以双孔平行检测。高、中、低拷贝数标准差分别是0.08、0.12、0.20，变异系数分别是0.44%、0.49%、0.65%，变异系数均小于1%。见表6。

表6 在不同拷贝数之间的CT值检测重复性Tab.6 CT values repeatability test among different concentration of bacterium

3 讨 论

本次研究的Taqman－MGB实时荧光PCR能够在一个封闭的反应体系中同时检测到只差一个碱基的突变情况，大大减少试验步骤，实验时间和对试剂的消耗，在实际应用中有很高的价值。考虑到用不同波长荧光素标记的双探针（FAM、HEX）可能会有互相的干扰，因此在优化体系时，首先对单通道的引物、探针浓度、退火温度等参数进行优化，在此基础上通过3种已优化好的单通道反应体系的引物和探针浓度的各种比例组合来对双通道的体系优化。以出现CT值越小、荧光值越大和节省成本的原则选择优化的参数。在优化双通道时还要考虑到双探针荧光值差距不能太大。因此选择了引物、探针终浓度最低的，并且一对引物和两条探针浓度都是1∶1组合。

评价荧光PCR体系优化的指标有相关系数R2和扩增效率E（E＝10（－1/斜率）－1）。双通道FAM 的相关系数相关系数 R2＝0.999，扩增效率E＝100.7%，HEX的相关系数R2＝0.999，扩增效率E＝95.3%，均符合优化实验的标准，实验结果可信，系统误差较小。

本研究检测的任何一份非结核分枝杆菌和常见呼吸道感染细菌标准菌株均未出现阳性，阴性产物经2%琼脂糖电泳，均未得到预期大小的PCR产物，说明引物和探针特异性强，特异性100%。在确定最低检测下限时，以能够产生稳定扩增为依据，即每个浓度梯度双份平行样中都出现扩增，且为稳定的CT值，2次的CT值不超过1个循环［6］。本研究实时荧光PCR最低下限均为1×101copies/μL，常规PCR 的最低下限为1.0×104copies/μL，荧光PCR的最低检测灵敏性是常规PCR的1 000倍。不同浓度同一时间或同一浓度在不同时间内检测到的结果来评价该体系的稳定性，结果显示CT值变异系数均小于1%，说明此体系重复性好，稳定性高。

双探针检测菌株突变结果与测序结果完全一致，符合率100%，特异性和敏感性均为100%，与Dario［7］等人报道结果一致。敏感性比van Doorn［8］等人（野生型探针70%，突变型探针82%）偏高，可能是因为本研究和Dario的检测标本是菌株，而van Doorn是痰标本。但特异性均为100%，说明该方法特异性高，与样本的成分无关。

通过本研究，我们建立了一种可以快速检测结核分枝杆菌katG基因突变来判断结核分枝杆菌异烟肼耐药的Taq Man－MGB荧光定量PCR方法，从DNA提取到发出检测报告，整个实验过程只需3 h，与普通PCR相比无需开盖跑电泳，减少污染，操作简单。与目前利用基因突变原理检测结核耐药的产品Geno Type·MTBDRplus、基因芯片相比，费用相对便宜，实验消耗时间少。与目前国际上最新的GeneXpert系统相比，费用低，且荧光PCR引物探针设计更加灵活，在我国实际操作性可行性强，是临床医生用药的一种有效快速的辅助手段，为进一步检测临床样本提供可能。

［1］中国人民共和国卫生部.全国结核病耐药性基线调查报告（2007－2008）［R］.北京：人民卫生出版社，2010，27－37.

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［4］van Soolingen D，de Haas PE，van Doorn HR，et a1.Mutations at amino acid position 315 of the kat G gene are associated with high－level resistance to isoniazid，other drug resistance，and successful transmission ofMycobacteriumtuberculosisin The Netherlands［J］.J Infect Dis，2000，182：1788－1790.

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［7］García de Viedma D，del Sol Díaz Infantes M，Lasala F，et al.New real－time PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance mutations and high－level isoniazid resistance mutations inMycobacteriumtuberculosis［J］.J Clin Microbiol，2002，40（3）：988－995.

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