王洪星 ，张雨良 ，罗志文 ，杨文君 ，刘志昕

（1.中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101；2.海南大学环境与植物保护学院，儋州571737）

聚合酶链式反应（PCR）是体外扩增DNA的一种技术，其能够在短时间内根据极微量的模板序列扩增出大量特异性DNA片断，扩增过程类似于核裂变。Mullis博士在1983年发明了该技术，PCR技术是现代分子生物学中最有价值的技术之一（David Clark，2005），随着科学技术的发展其又衍生出多种类型的相关技术，包括差异显示PCR、实时定量PCR、巢式PCR、多重PCR和不对称PCR等（萨姆布鲁克，2002）。

PCR方法的广泛应用及其相关技术的顺利进行均离不开PCR引物的合理设计。可以说，PCR引物的合理设计是任何PCR反应能否进行及其产物的特异性、产率高低的关键。目前许多计算机软件如Primer Premier 3.0，Primer Premier 5.0，Oligo 6.0等均可用于引物的设计。但由于软件自身存在的局限性，其设计的引物并无法满足实验者不同需要。目前最常用的是计算机辅助设计，即实验者根据PCR引物设计的原则并结合自己的经验人工设计引物，然后选择合适的软件分析引物的合理性。

1 材料和方法

1.1 实验材料及软件

实验用甘蔗样品采自海南两院甘蔗种植基地。 Trizol（Invitrongen），SYBR Green supermix（TaKaRa）、RTPCR试剂盒PrimeScript TM One-Step Ver.2.0购自宝生物工程（大连）有限公司，PCR产物回收试剂盒（上海生物工程有限公司），反转录酶、Taq酶及其它生物试剂均购自北京全式金生物科技有限公司，其它药品为国产分析纯。Primer Premier 5.0、Oligo6.0、DNAMAN等软件于http://www.bio-soft.net下载。

1.2 甘蔗总RNA提取和RT-PCR

从待检测甘蔗植株上取幼嫩组织，以TRIzol法（余爱丽，2004）得到较理想的RNA样品。……