梁芳慧 靳丹虹 董丽丹

鹿茸为鹿科动物梅花鹿(Cervus nippon Temminch)或马鹿(Cervus elaphus Linnaeus)的雄鹿密生茸毛的未骨化的幼角［1］。鹿茸具有增强免疫功能、抗氧化、抗疲劳和抗衰老等药理作用［2］。在抗氧化及抗衰老作用中，鹿茸中的次黄嘌呤、对羟基苯甲醛和磷脂会抑制与神经系统老化有关的单胺氧化酶(MAO)的活性［3］。目前，测定次黄嘌呤含量的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)和高效毛细管电泳法［4，5］。本文将超声辅助提取与反相高效液相色谱结合测定经焙干处理后鹿茸样品中的次黄嘌呤的含量，并采用正交设计法对提取条件进行了优化。本方法简便、准确、可靠，适用于焙干鹿茸样品中次黄嘌呤的定量分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试药 高效液相色谱仪(安捷伦1200型)，KQ5200超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)，JB/T5374-1991电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。

次黄嘌呤对照品(北京奥博星生物技术责任有限公司，含量＞98%，批号:20040815);超纯水，甲醇(色谱纯)，乙醇(分析纯)，冰醋酸(分析纯)均购于天津大学科威公司;鹿茸经切片，焙干粉碎后过100目筛(鹿茸来源，长春市双阳鹿场)。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件及系统适应性 色谱柱:AgilentTC C18(250 mm×416 mm，5 μm);流动相:含0.07%冰醋酸的3%甲醇溶液;流速:1.0 ml/min;检测波长:254 nm;柱温:20℃;进样量20 μl。按次黄嘌呤峰计算，理论塔板数不低于3000。在实验条件下次黄嘌呤的保留时间为9.59 min，与相邻未知峰的分离度＞1.5。

1.2.2 样品前处理 准确称取焙干鹿茸样品1.0000 g，置于250 ml具塞锥形瓶中，加50%乙醇40 ml，放入60℃水温的超声波中提取40 min后，以12000 r/min转速离心3 min，取上清液于100 ml容量瓶中，用50%乙醇定容，再用0.45 μm滤膜过滤，滤液待用。

1.3 结果

1.3.1 测定波长的选择 取次黄嘌呤的50%乙醇溶液，经紫外-可见分光光度计扫描，确定254 nm为检测波长。

1.3.2 HPLC流动相的选择 用冰醋酸含量不同的甲醇水溶液作为流动相进行比较实验，结果表明0.07%冰醋酸的3%甲醇溶液作流动相，样品中的次黄嘌呤能得到较好分离。

1.3.3 标准曲线的绘制 准确称取5 mg次黄嘌呤标准品，置于50 ml量瓶中，加水定容至刻度，混匀。浓度为100 mg/L的标准品储备液。取储备液配制 1.0、2.0、5.0、10、15、20、25、30 mg/L标准溶液，按(2.2.1)色谱条件进行测定，绘制标准曲线。次黄嘌呤在1～30 mg/L浓度范围内与峰面积具有良好的线性关系，回归方程y=68.749x-8.0225，R2=0.9997。

1.3.4 超声辅助提取条件的优化 试剂浓度、试剂体积、超声时间、超声温度是影响超声辅助提取的主要因素。本实验选择乙醇试剂浓度A分别为40%、50%和60%，试剂体积B(g:ml)分别为1∶20、1∶30和 1∶40，超声时间 C 分别为 30 min、40 min和50 min，超声温度 D 分别为 40℃、50℃和 60℃为待考察的4种因素和3个水平，选用L9(34)正交表，进行实验。

根据对正交实验结果的考察和方差分析表明，各影响因素对焙干鹿茸中次黄嘌呤提取效果的影响顺序为A＞C＞B＞D。焙干鹿茸中次黄嘌呤的最佳提取工艺为A2B3C3D2，即用40 ml50%乙醇60℃提取40 min，焙干鹿茸中次黄嘌呤的提取量最高。

1.3.5 精密度实验 在(2.2.1)色谱条件下，将2 mg/L次黄嘌呤标准溶液连续进样6次，每次进样20 μL，测定结果RSD=2.6%(n=6)，表明本法具有一定的精密性，选定的色谱条件稳定。

1.3.6 稳定性实验 准确称取鹿茸样品1.0000 g，按(2.2.2)对样品进行前处理，每隔2 h取20 μL进样，12 h内计算次黄嘌呤的含量变化，RSD ＜2.3%，提取液在12 h内稳定。

1.3.7 回收率实验 准确称取一定质量焙干鹿茸样品(n=3)，分别加入低、中、高三种浓度的次黄嘌呤标准品，按(2.2.2)对样品进行前处理，(2.2.1)色谱条件进行测定，计算回收率，结果表明平均加标回收率在97.5% ～102.9%间。

1.3.8 样品测定 准确称取两种不同批次的焙干鹿茸样品1.0000 g按最佳实验条件提取和测定，结果两种不同批次鹿茸样品(n=3)中次黄嘌呤的含量分别为0.845 mg/g和1.074 mg/g。

2 讨论

本文建立的超声辅助提取、反相高效液相色谱测定焙干鹿茸样品中次黄嘌呤的方法，具有良好的精密度和重现性，而且简便快速，对设备要求低，可用于焙干鹿茸药材中次黄嘌呤测定，且具有较好的实操性，能为鹿茸药材的质量评价提供可靠的测定方法和参考依据。

［1］国家药典委员会.中国药典.北京:化学工业出版社，2000:264-265.

［2］王本祥，陈晓光.次黄嘌呤对单胺氧化酶的抑制作用.药学学报，1989，24(8):573.

［3］杨秀伟.花鹿茸、马鹿茸碱基成分的HPLC定量分析和其MAO活性抑制作用.中草药，1995，26(1):17.

［4］周冉，李淑芬.RP-HPLC同时快速测定鹿茸药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷含量.药物分析杂志，2009，29(4):575-578.

［5］阮婧华.毛细管区带电泳法同时测定冬虫夏草中多种核苷及其碱基的含量.沈阳药科大学学报，2002，19(2)∶112.