张 颖，鲁 承，赵文婧，陈海迪，高 旭

（延边大学农学院动物医学系，吉林延吉133000）

鹅细小病毒病是由鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）引起的主要侵害4日龄～20日龄雏鹅的一种病毒性传染病，该病病程短，传染性强，病死率高，给养鹅业造成了严重的危害［1-3］。该病毒由我国学者方定一于1956年在江苏扬州首次发现。研究发现VP3基因是GPV核衣壳的主要成分，约占总蛋白含量的80%，具有较高的保守性，能够诱导机体产生中和抗体，是GPV的主要保护性抗原［4-5］。本研究拟以本课题组前期分离的延边株（YBLJ）鹅细小病毒为毒株，克隆VP3基因和构建真核表达载体，并研究GPV的VP3基因在Vero细胞中表达情况，为进一步研制GPV的VP3基因核酸疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌种 GPV（YBLJ株）为本实验室从延边某养鹅场发生鹅细小病毒病的病死鹅脾脏中分离得到。大肠埃希菌JM109、pcDNA3.1（＋）菌株由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 LipofectamineTM 2000转染试剂盒为Invitrogen公司产品；限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ，以及ExTaq酶、DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒和反转录试剂盒均为宝生物工程（大连）有限公司产品；小鼠抗GPV VP3蛋白单抗为本试验室制备；FITC标记的兔抗小鼠IgG二抗为Abcam公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据已克隆的鹅细小病毒 YBLJ株 VP3基因序列 （GenBank：JN836326）［6］，利用Loligo 6.0软件设计合成了一对引物，由上海英骏生物技术有限公司合成，扩增片段长度为1 605bp。序列如下：上游5′-ATAAGCTTGCCACCATGGCAGAGGGAGGAG-3′（HindⅢ）；下 游5′-CGGGCTCGAGTTACAGATTTTGAGTT-3′（XhoⅠ）。

1.2.2 PCR扩增及克隆 以提取的GPV基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应程序为：95℃5min；94℃40s，58℃45s，72℃1min 40s，进行30个循环；72℃10min。纯化回收VP3基因片段，与克隆载体pMD-18T连接，转化至JM109感受态细胞。将PCR及酶切鉴定正确的重组质粒送往上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。……