高婉俊，王 静，林 鸷，曹伟伟，张彦明

（西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100）

轮状病毒（Rotavirus，RV）属于呼肠病毒科（Reoviridae）轮状病毒属（Rotavirus），是引起婴幼儿和多种幼龄动物急性病毒性腹泻的主要病原体［1］。仔猪轮状病毒性腹泻是由猪轮状病毒（Porcine rotavirus，PoRV）引起的，感染PoRV的仔猪会出现厌食、呕吐、腹泻、脱水和酸碱平衡紊乱等症状［2］，而且容易继发其他细菌性感染［3］，导致仔猪病死率升高，给养猪业造成巨大的损失。近几年的研究发现，PoRV与人的非典型RV有密切的关系［4－6］，猪可能会成为人类新型RV的“贮存器”。

PoRV的基因组由11个双链RNA节段构成，分别编码6个结构蛋白（VP1～VP4、VP6、VP7）和6个非结构蛋白（NSP1～NSP6）。其中，VP6由第6基因编码，占病毒蛋白总量的51%，是内层衣壳的主要组成成分，并且具有转录酶活性，在RV的复制过程中发挥重要作用［7］。根据RV抗原VP6的差异可将其分为7个组（A～G），其中A、B、C、E组RV可感染猪，且在猪群中感染最为普遍的是A组RV。VP6具有很强的免疫原性，可刺激机体产生Ig A、IgG，并且具有组特异性，因此，VP6在轮状病毒感染的诊断上是一个重要的检测指标［8］，而且在疫苗开发方面有潜在的应用价值［9－10］。

目前，RV的检测方法主要有电镜观察、ELISA［11－12］、核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳［13］、核酸杂交和 RT－PCR［14］，以及实时荧光定量 PCR［15］。经典的病原检测方法是电镜技术（EM）和分离培养。但是EM技术设备昂贵，病料处理繁琐，并且要求每毫升样品中至少包含约106个病毒颗粒［16］，敏感性不高，不适合大规模临床检测。ELISA方法虽然操作简单，可肉眼判断结果，但特异性和灵敏性相对较低，且不能有效地进行定量检测［17］。检测病毒基因组RNA的PAGE电泳方法特异性和灵敏度较好，能在基因水平上对不同毒株间的异同进行初步分析，但是这种方法操作繁琐且所需时间较长，容易造成RNA的降解，从而影响检测结果。RT－PCR方法虽然是目前RV检测方法中特异性较强的方法，但不能够准确定量，而且反应结果需要电泳后才能判断。实时荧光定量PCR与常规PCR相比，除了灵敏度更高和特异性更强外，自动化程度高，无污染、实时性好，能实现多重反应，而且结果准确可靠。目前实时荧光定量PCR技术已得到广泛应用，成为病毒检测的有效手段。本试验拟建立一种基于VP6基因的有效检测PoRV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，并与常规RTPCR方法进行了比较，旨在为PoRV的检测提供有效手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器与试剂 冷冻离心机，德国Eppendorf公司产品；iQ5荧光定量PCR仪，美国Bio－Rad公司产品；普通PCR仪，Bio－Rad公司产品；NanoDrop ND－1000型紫外分光光度计，美国Thermo Scientific公司产品；凝胶成像系统，英国Syngene公司产品。p MD 19－T Vector、PrimeScript RT reagent Kit 和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，宝生物工程（大连）有限公司产品；Trizol Reagent，Invitrogen公司产品；柱离心型DNA凝胶回收与纯化试剂盒和高纯质粒小量提取试剂盒，威格拉斯生物技术（北京）有限公司产品。

1.1.2 病毒株及细胞系 猪轮状病毒OSU株（G5型）和罗猴肾细胞系（MA－104）均购自中国兽医药品监察所；猪瘟病毒石门株（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪圆环病毒－2型（PCV－2）均由西北农林科技大学预防兽医学平台实验室保存；永生化猪小肠黏膜上皮细胞系（SIEC），由本实验室建立并保存。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank中登录的PoRV OSU株 VP6基因序列（AF317123.1）用Primer Premier 5软件设计了一对扩增VP6基因片段的特异性引物，上游引物 P1：5′－TGCTGGATCAGAAATTCAGG－3′，下游引物P2：5′－TAGTGGCACGACATGTTCAA－3′，预期扩增产物长度为94 bp，该引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

1.2.2 质粒标准品的制备

1.2.2.1 病毒 RNA 的提取 复苏 MA－104细胞于直径60 mm的细胞培养皿中，至细胞铺满皿底的80%时，用无血清的MEM培养基冲洗3次，接入事先用胰酶激活的猪轮状病毒稀释液，37℃吸附1 h。吸附结束后吸出病毒液，用无血清的MEM培养基于37℃、5%的CO2培养箱中培养72 h，收取细胞培养物。取200μL培养物加入1 mL Trizol Reagent混匀，室温静置5 min；加入200μL氯仿，颠倒混匀30 s，4℃、12 000 r／min离心15 min，小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，震荡混匀，室温静置10 min；4℃、14 000 r／min离心10 min，弃上清；沉淀用800μL 750 mL／L的乙醇于4℃、8 500 r／min离心5 min洗涤两次，弃上清，沉淀干燥5 min；以20μL DEPC水溶解RNA。

1.2.2.2 cDNA的逆转录合成 按照宝生物工程（大连）有限公司生产的PrimeScript RT Reagent Kit说明书进行，采用20μL体系：5×PrimeScript buffer 4μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1μL，Oligo d T primer（50 μmol／L）1μL，Random 6 mers（100μmol／L）1μL，RNA Template 6μL，最后用 RNase Free d H2O补足20μL；按以下程序进行反转录反应：37℃15 min，85℃5 s。合成的cDNA于－20℃保存备用。

1.2.2.3 PoRV标准品的制备与鉴定 以cDNA为模板进行PCR反应，采用25μL反应体系：2×Taq Master Mix 12.5μL，上、下游引物各0.5μL，反转录产物4μL，灭菌双蒸水7.5μL。PCR反应条件为：94℃5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃15 s，35个循环；72℃10 min；12℃终止反应。取扩增产物于20 g／L琼脂糖凝胶中电泳，观察结果。切取目的片段用DNA凝胶回收与纯化试剂盒纯化回收，与p MD 19－T Vector连接后转化 DH5α感受态细胞。在含氨苄青霉素的培养板上37℃培养12 h～16 h，挑取单个菌落，增菌后用质粒小量提取试剂盒提取质粒进行PCR鉴定，将筛选的阳性重组质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。用DNA Star软件与GenBank上已有的OSU株VP6基因序列进行比对分析。挑取序列正确的质粒作为标准品，用紫外分光光度计测浓度后根据公式计算拷贝数［17］。

1.2.3 荧光定量PCR检测方法的建立

1.2.3.1 荧光定量PCR反应条件的优化 为了得到更高的荧光增幅并使反应有最小的循环数（Ct），对荧光定量PCR的循环条件进行两步法和三步法摸索，并将退火温度从55℃依次递增至60℃，递增步长为1℃，对退火温度进行优化。

1.2.3.2 荧光定量PCR敏感性试验及标准曲线的建立 将质粒标准品10倍系列稀释，使其浓度在1.0×101～1.0×109拷贝／μL之间，按1.2.3.1中优化后的反应条件进行PCR反应，并设置以d H2O为模板的阴性对照，观察该方法的敏感性，标准曲线由iQ5荧光定量PCR仪自动生成，X轴代表每个浓度标准品模板中所含病毒起始含量以10为底的对数，Y轴代表各个梯度质粒标准品扩增时达到阈值所需的循环数。

1.2.3.3 特异性试验 用猪轮状病毒OSU株（PoRV）、猪瘟病毒石门株（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的cDNA以及猪圆环病毒2型（PCV－2）的基因组DNA为模板进行荧光定量PCR，并以稀释度为1.0×108拷贝／μL的质粒标准品为阳性对照，并设置以dd H2O为模板的阴性对照，检验该方法的特异性。

1.2.3.4 重复性试验 选取1.0×106拷贝／μL的质粒标准品，在同一批次内重复10次，计算批内变异系数；并在不同时期将该质粒标准品分别再重复10个批次，每次3个重复，取平均值，计算批间变异系数，检验该方法的重复性。

1.2.4 荧光定量PCR与普通RT－PCR的比较 将1.0×1010～1.0×101拷贝／μL的质粒标准品分别进行常规RT－PCR和荧光定量PCR，对比2种方法的灵敏度。

1.2.5 荧光定量PCR的初步应用 给永生化猪小肠黏膜上皮细胞（SIEC）接种病毒（MOI＝30），分别在感染后24、48、72 h收获细胞以及上清液，用Trizol法提取细胞总RNA以及病毒液的基因组RNA，测浓度后进行反转录，用已建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测细胞内以及上清液中Po RV的含量。

2 结果

2.1 靶基因的扩增及验证

经RT－PCR扩增，得到大小约为94 bp的目的片段，与预期结果相符（图1）。将此特异性片段与p MD 19－T Vector连接，并对重组质粒p MD 19－TVP6进行测序，测序结果经BLAST分析，结果显示，扩增的目的片段与PoRV OSU株VP6基因序列的一致性为100%，并且与NCBI数据库中其他猪A组轮状病毒毒株，如猪A组轮状病毒Wa株同源性大于90%，说明对该毒株进行检测对其他猪A组轮状病毒具有参考意义。

图1 PoRV引物特异性的RT－PCR鉴定Fig.1 Specificity of primers for PoRV detected by RT－PCR

2.2 敏感性试验及标准曲线的建立

用紫外分光光度计测得重组质粒DNA的浓度为178 ng／μL，根据公式［18］，经过计算得出其拷贝数约为1.0×1011拷贝／μL，对该质粒进行10倍梯度稀释，选择1.0×109～1.0×101拷贝／μL的质粒作为模板，按照优化的最佳反应条件：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，上、下游引物各0.8μL，模板1μL，灭菌双蒸水7.4μL，总体积20μL；最佳反应条件为：95℃30 s；95℃5 s，58℃20 s，72℃15 s，40个循环进行SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应，从图2可以看出，本研究建立的荧光定量PCR方法的检测灵敏度最低可达到1.0×101拷贝／μL。在1.0×109～1.0×102拷贝／μL范围内线性关系良好，经iQ5荧光定量PCR仪软件自动分析得到了荧光定量PCR方法的标准曲线（图3）。扩增效率E＝95.7%，相关系数R2＝0.999。

图2 Po RV荧光定量PCR方法的敏感性试验结果Fig.2 Sensitivity test of real time fluorescent quantitative PCR for PoRV detection

图3 实时荧光定量PCR方法的标准曲线Fig.3 The standard curve forreal time fluorescent quantitative PCR

2.3 熔解曲线的分析

从熔解曲线分析可知，在熔解温度Tm＝81℃±0.5℃出现单一的特异性峰，表明该反应特异性良好（图4）。

图4 实时荧光定量PCR熔解曲线的建立Fig.4 The melting curve for real time fluorescent quantitative PCR

2.4 特异性试验结果

采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测PoRV、CSFV、PRRSV、TGEV 和PCV－2，用1.0×108拷贝／μL的质粒标准品作为阳性对照，只有阳性对照和PoRV出现有效扩增的荧光信号（图5），表明本研究建立的荧光定量PCR方法对Po RV有良好的特异性。

图5 PoRV荧光定量PCR方法的特异性试验结果Fig.5 Speciality test of real time fluorescent quantitative PCR for PoRV detection

2.5 重复性试验

取1.0×106拷贝／μL的质粒标准品进行重复10次的批内试验，从扩增曲线（图6）及对应的Ct值（表1）可以看出，该质粒标准品的批内变异系数为0.43%；将其分为不同的时期测定10次，每次3个重复，结果显示该质粒标准品的批间变异系数为1.42%，说明本研究建立的荧光定量PCR方法具有良好的重复性（表1）。

图6 PoRV荧光定量PCR方法的重复性试验结果Fig.6 Pepeatability test of real time fluorescent quantitative PCR for PoRV detection

2.6 荧光定量PCR方法与普通RT－PCR方法的比较

以1.0×1010～1.0×101拷贝／μL的质粒标准品为模板，每个浓度取1.0μL分别进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR和普通RT－PCR。SYBR GreenⅠ荧光定量PCR对质粒标准品的检测下限为1.0×101拷贝／μL，而普通RT－PCR的检测下限为1.0×103拷贝／μL（图7），表明SYBR GreenⅠ荧光定量PCR比普通RT－PCR灵敏度高出2个数量级。

2.7 Po RV感染SIEC不同时间段细胞及上清液中病毒量的检测

用本试验所建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对永生化猪小肠黏膜上皮细胞（SIEC）感染了PoRV OSU株（MOI＝30）24、48、72 h的细胞内及上清液中的病毒含量进行检测，结果见表2。

表1 实时荧光定量RT－PCR检测PoRV的组内及组间统计结果Table1 The intragroup and intergroup statistical results of PoRV detection by florescence quantitative real time fluorescent quantitative RT－PCR

图7 10倍梯度稀释的质粒标准品常规PCR扩增结果Fig.7 Amplification results of standard plasmid of 10 fold＇s serial dilution through the conventional PCR

表2 PoRV感染SIEC不同时间段细胞内及上清液中病毒量的检测结果Table2 The results of real－time PCR of viral loads in SIEC and supernatant at different periods after infection with PoRV

3 讨论

轮状病毒是引起人和各种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原，在世界范围内威胁着人类的健康和影响养殖业的发展［18］。猪轮状病毒常呈地方流行性，常与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、大肠埃希菌、沙门菌等混合感染，造成仔猪死亡率升高。许多成年猪往往会发生隐性感染并不断向外排毒，成为主要的传染源，因此，迫切需要建立一种能够在Po RV感染初期进行检测的方法。

近年来，荧光定量PCR结合熔解曲线分析方法在病原体检测方面得到了广泛的应用［19－21］，该技术可实现定量检测，比传统的PCR方法具有更高的灵敏度和特异性，其应用价值已得到广泛的认可。荧光定量PCR技术有探针法和SYBR GreenⅠ染料法两种方法。探针法较SYBR GreenⅠ染料法特异性高、敏感性好，但探针区域若发生变异将会导致假阴性结果，对于极易发生变异的区域，虽采用多个探针可以避免这一缺陷，但探针设计、标记及纯化成本高，技术上的困难较难克服，双重探针尤为困难，因此探针法不适合大规模的临床应用。相反，基于SYBR GreenⅠ染料的荧光定量PCR技术成本低廉，只需要设计出特异性的引物即可有效地进行病毒拷贝数的检测，虽然引物二聚体及非特异性扩增可能会影响检测结果的特异性，但结合熔解曲线分析后便可有效克服这一缺陷，因此SYBR GreenⅠ染料法对于临床样品的检测更具实际意义。

目前将实时荧光定量PCR技术用于检测人轮状病毒的研究比较普遍，而用于动物轮状病毒的研究较为少见。Pang X L等［22］针对人A组轮状病毒的NSP3基因保守区设计引物，建立了SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法，并将该方法与传统的电镜技术和普通套式PCR方法进行比较，证明荧光定量PCR检测技术比上述两种检测方法高出4个数量级，而且用时更少、操作更简便，不容易造成污染。陈小金等［23］根据猪轮状病毒OSU株的VP7基因序列设计了一对特异性引物，建立了猪轮状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法，并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评价，但是作为检测的靶标，作为组抗原并且含量最为丰富的VP6是更好的选择。因为VP7决定病毒的G血清型，Coulson B S等［24］经序列分析比较发现，VP7氨基酸序列中存在6个高变区（A～F）。Green K等的研究确定了VP7氨基酸序列中存在9个高变区（VR1～VR9）［25］，这些高变区与中和抗原决定簇位点的形成关系密切，以上的研究结果均表明，VP7基因容易发生变异，从而形成新的血清型，造成轮状病毒性腹泻的反复流行。因此，若针对VP7基因设计引物，只能检测同一血清型的轮状病毒，而目前在人和动物中间流行的轮状病毒往往不是单一的血清型，这就给轮状病毒的检测增加了难度。而且从基因序列来看，VP7基因重叠序列较多，给引物设计造成了极大的困难，本实验室亦尝试过针对PoRV OSU株的VP7基因序列设计特异性引物，但是均得不到理想的PCR扩增产物，因此改用在A组RV中高度保守的VP6作为检测的靶标，而且考虑到VP6在病毒感染的早期就开始合成，参与病毒粒子的组装，因此更适合A组轮状病毒早期感染的检测。

本试验以SYBR GreenⅠ作为荧光染料，以RV保守序列VP6基因为扩增靶标，建立了检测A组猪轮状病毒的荧光定量PCR方法。该方法对猪轮状病毒具有很好的特异性，在1.0×102～1.0×109拷贝／μL范围内具有很好的线性关系（R2＝0.999），扩增效率为95.7%，最低检测病毒拷贝数为1.0×101拷贝／μL，比普通RT－PCR敏感性高出2个数量级，并且重复性良好，批内和批间变异系数均小于2%，说明该方法具备很好的稳定性。更重要的是，本试验首次检测了PoRV OSU株在永生化猪小肠上皮细胞（SIEC）中的增殖情况。目前Po RV致病机理的研究一直没有很大的突破，主要原因就是缺少理想的靶细胞。研究人轮状病毒致病机理所用的细胞系主要有恒河猴肾细胞系MA104、人结肠腺癌细胞系Caco－2和人结肠癌细胞系 HT－29，而Po RV主要侵害猪的小肠上皮细胞，用上述细胞研究PoRV的致病机理说服力不够强，我们用猪轮状病毒OSU株感染永生化猪小肠黏膜上皮细胞（SIEC），用荧光定量PCR方法对感染了PoRV 24、48、72 h的SIEC内以及上清液中的病毒含量进行了定量检测，结果表明所建立的实时荧光定量PCR方法可用于A组Po RV早期感染的诊断和定量分析及流行病学监测，更为重要的是，本试验表明PoRV可以很好地在SIEC中增殖，因此SIEC可以作为下一步开展Po RV致病机理研究较为理想的细胞材料。

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