猪A组轮状病毒实时荧光定量PCR 检测方法的建立
2012-09-26高婉俊曹伟伟张彦明
高婉俊,王 静,林 鸷,曹伟伟,张彦明
(西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100)
轮状病毒(Rotavirus,RV)属于呼肠病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus),是引起婴幼儿和多种幼龄动物急性病毒性腹泻的主要病原体[1]。仔猪轮状病毒性腹泻是由猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)引起的,感染PoRV的仔猪会出现厌食、呕吐、腹泻、脱水和酸碱平衡紊乱等症状[2],而且容易继发其他细菌性感染[3],导致仔猪病死率升高,给养猪业造成巨大的损失。近几年的研究发现,PoRV与人的非典型RV有密切的关系[4-6],猪可能会成为人类新型RV的“贮存器”。
PoRV的基因组由11个双链RNA节段构成,分别编码6个结构蛋白(VP1~VP4、VP6、VP7)和6个非结构蛋白(NSP1~NSP6)。其中,VP6由第6基因编码,占病毒蛋白总量的51%,是内层衣壳的主要组成成分,并且具有转录酶活性,在RV的复制过程中发挥重要作用[7]。根据RV抗原VP6的差异可将其分为7个组(A~G),其中A、B、C、E组RV可感染猪,且在猪群中感染最为普遍的是A组RV。VP6具有很强的免疫原性,可刺激机体产生Ig A、IgG,并且具有组特异性,因此,VP6在轮状病毒感染的诊断上是一个重要的检测指标[8],而且在疫苗开发方面有潜在的应用价值[9-10]。
目前,RV的检测方法主要有电镜观察、ELISA[11-12]、核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳[13]、核酸杂交和 RT-PCR[14],以及实时荧光定量 PCR[15]。经典的病原检测方法是电镜技术(EM)和分离培养。但是EM技术设备昂贵,病料处理繁琐,并且要求每毫升样品中至少包含约106个病毒颗粒[16],敏感性不高,不适合大规模临床检测。ELISA方法虽然操作简单,可肉眼判断结果,但特异性和灵敏性相对较低,且不能有效地进行定量检测[17]。……
