马 博，张 红

(1武警广东公安边防总队医院，广东深圳 518000;2广西医科大学)

卵胞质内单精子注射技术(ICSI)作为一种有效辅助生殖技术自从出现以来，研究者就不断尝试不同的 ICSI注射方式［1～5］，试图发现最佳的 ICSI操作方法。2011年3～11月，我们对同源卵母细胞在进行ICSI操作时不同程度地回吸胞质，并对受精及胚胎发育情况进行了观察。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 在本院接受辅助生殖治疗，采用ICSI作为授精方式，且取卵后成熟卵子数量≥12个(不含无精子症患者)的不孕症患者36例。女方年龄23～38(30.4±3.7)岁，不孕年限为 3 ～12(5.3±3.1)年。36例中，原发性不孕29例，继发性不孕7例。28例为男方因素不孕，3例为不明原因性不孕，5例为前次行体外受精联合胚胎移植(IVF)治疗后不受精或受精率低。

1.2 ICSI方法 ①采用常规达菲林长方案，前1个月经周期第21天开始降调节，肌注达菲林1～1.25 mg，月经周期第3～5天查血清卵泡生成素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)值，达充分降调节标准后开始用果纳芬促排卵。超声检查发现1个直径≥18 mm或2个≥16 mm的卵泡的当晚，肌注HCG 1万U，34～36 h后经阴道超声下引导采卵。采卵后第3天行胚胎移植，剩余优质胚胎冷冻。黄体支持为采卵日开始肌注黄体酮60 mg/d。②精子采用密度梯度离心法准备。③取卵后将卵子置于37℃、含5%CO2培养箱中，孵育4～6 h后行ICSI。为减少干扰因素，在行ICSI时将全部卵子的极体固定在12点钟的位置，在3点钟位置注射，授精后16～18 h观察授精情况，以出现双原核为正常受精，授精后64～66 h行移植前胚胎观察，记录胚胎卵裂球数目、对称性及碎片情况，以胚胎卵裂球≥6个、大小均匀、胞质碎片 ＜10%的胚胎定为优质胚胎［6］。④分组及操作:将获取的成熟卵子分为约等的3份，分别为A、B、C组。A组:在行ICSI操作时，注射针回吸卵细胞胞质不超过透明带(如图1，不超过A点);B组:ICSI操作时，注射针回吸卵细胞胞质超过透明带，但在距透明带65 μm(约为卵子半径)以内(如图1，在A、B点之间);C组:ICSI操作时，注射针回吸卵细胞胞质超过透明带，且距透明带的位置大于65 μm(如图1，超过B点)。授精后3 d内连续观察卵细胞的受精情况及胚胎发育情况。

1.3 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验;计数资料采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

图1 ICSI操作中回吸胞质作用点

36例患者共获得卵子713枚，其中成熟卵子601枚，A、B、C 组分别有199、217、185枚。36 例均未出现受精率低或不受精的情况。三组卵细胞受精情况比较见表1。A、B、C组卵裂率分别为93.29%、92.49%、93.71%，优质胚胎率分别为 64.05%、56.25%、59.7%，其中A组优质胚胎率明显高于B、C组(P均 ＜0.05)。

表1 三组卵细胞受精情况比较(%)

3 讨论

ICSI对卵母细胞的激活主要来自注射针的机械刺激和注入精子的生物刺激［7］，受精激活是受精的开始，正常受精形态学上表现为雌雄原核的形成，并释放出第2极体。单精子注射时回吸胞质是ICSI操作的必须步骤之一，能起到激活卵子的作用［8］。有学者认为剧烈回吸胞质是ICSI成功的关键［9］，然而又有研究显示这种操作会对胞膜完整性及细胞器产生破坏作用［10］。

卵细胞是有极性和结构的生殖细胞，回吸胞质有可能破坏线粒体、微管及纺锤体等细胞器［11］。微管是纺锤体的重要组成部分，如果微管系统受损，可引起染色体不正常分离，产生单倍体或3倍体，从而影响胚胎发育潜能。若损伤微丝系统，也可引起纺锤体异常，卵细胞染色体可全部分给第2极体，或全部滞留于卵细胞内，产生单原核或3原核。纺锤体遭到破坏可能导致卵子死亡或形成非整倍体。故认为轻柔且少量的回吸胞质有利于卵子的受精和胚胎的发育。基于不同的研究结果，笔者在ICSI操作时不同程度地回吸胞质，并分析成熟卵子的受精率、卵裂率和胚胎质量等参数，评估不同回吸操作对卵子受精及胚胎发育的影响。

研究显示，ICSI后卵细胞的退化率为4.6% ～7.1%［12］。本研究中 ICSI后，C 组卵细胞退化率(8.11%)略高于 A 组(5.53%)及 B 组(6.00%)，C组的未受精率(13.51%)显著高于A组(6.53%)及B组(6.00%);提示大量回吸胞质会提高卵细胞的未受精率及退化率，这可能与该操作破坏卵细胞的细胞器、分子分布及减数分裂时纺锤体功能的完整性有关［11］。本研究对ICSI后三组的卵裂率及优质胚胎率进行比较后发现，数据无显著差异，但A组优质胚胎率(64.05%)高于其他两组。上述结果提示，在ICSI时少量回吸胞质，可提高卵细胞的受精率，减少退化率，有利于胚胎发育。本研究还发现，ICSI治疗后C组单原核的出现率(0)低于A组(4.52%)及B组(6.91%)，推测大量回吸胞质有助于减少卵细胞的异常受精率，其具体机制有待进一步探讨。

综上所述，ICSI操作中不同程度回吸卵细胞胞质对卵细胞的受精均无明显影响，但大量回吸胞质可导致卵细胞退化率及不受精率增高。

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