程振宁

北京特度生物科技有限公司(100005)

女性恶性肿瘤患者中，保持生育能力是一种可行的选择，尤其对于某些早期癌症患者，包括早期宫颈癌、高分化卵巢癌、IA单侧卵巢癌等，这些患者肿瘤控制或者治愈后有较强的生育要求。本文就女性肿瘤患者卵细胞冻存历史、相关研究及现存问题进行综述。

1 卵细胞冻存历史

卵细胞的冻存技术较胚胎冻存晚，1983年Veeck等[1]首次将未成熟卵细胞成功妊娠。1986年首次成熟卵母细胞冻融后婴儿出生，1995年卵母细胞冻融与细胞内单精子注射技术结合，随后陆续有卵母细胞冻融婴儿出生[2]。2013年美国新诊癌症患者生育能力保留指南更新，卵母细胞冻存地位得以提升，不再以经验性选择做为标准措施。近年来，卵细胞冻存技术以及生育能力保持成为关注的热点[3-4]。我国在2004年慢速程序化冷冻卵细胞培育的首例试管婴儿出生，2006年玻璃化冷冻成熟卵细胞取得成功，同年国内首例“三冻婴儿”(冻精、冻卵、冻胚)诞生 ,标志着我国的配子、胚胎冷冻技术已达到国际水平。

2 卵细胞冻存相关研究

2.1 冻存技术的研究

目前较成熟冻存技术包括：慢速冻存、快速冻存、玻璃化冻存等。其中，玻璃化冻存具有标准化程度高、简单、可重复以及高效等特点[5]。玻璃化冷冻法是利用高浓度的冷冻保护剂快速冷冻技术，快速降温过程中样本脱水，剩余水分直接转化为非晶体化状态，并在-196 ℃的低温环境中固定于玻璃化状态。玻璃化冻存法也是美国“卵子银行”主流的冻存方法[6-7]。随着纳米、微米技术与仿生学材料、合成材料的研究与应用，给超低温冻存带来创新和技术进步，如最小容量玻璃化技术ref36、闭合系统玻璃化冻存法[8-9]。

在临床中，许多肿瘤患者在短时间内要求保持生育能力，如在卵巢癌和子宫内膜癌介入治疗前。保持生育能力的唯一选择是快速获得卵母细胞并进行冷冻，这一过程中常常涉及未成熟卵母细胞的冷冻。GV期、MI期卵母细胞的成熟需要特殊培养基(如MI99、IVF卵裂液)和严格的培养条件(6%CO2、5% O2、89% N2，37℃)。Chan等[10]研究，从5例次日接受择期癌症手术的患者取出53颗卵母细胞，其中36颗体外成熟(成熟率67.9%)。有研究显示，GV期、MI期卵细胞可能对慢速冷冻的耐受更好，但随之而来的染色体多倍体和非整倍体情况不可以避免[11-12]。更大的困难在于GV期、MI期的卵细胞冷冻解冻后体外成熟，冷冻过程降低了未成熟卵子发育成熟的潜能，且目前尚无未成熟卵细胞冷冻后复苏成功生育的案例报道。

2.2 卵细胞冻存生育结果的研究

高质量综述和临床对照研究肯定了玻璃化冻存的效果。Paramanantham等[13]对过去30年卵细胞冻存研究的180篇文献进行综述，对慢速冻存与玻璃化冻存复苏后卵细胞情况进行比较，从存活率(57.9%比78.9%)、受精率(64.7%比 72.8%)、临床妊娠率(7.6%比18.2%)、受精卵种植率(4.3%比9.3%)得出玻璃化技术优于慢速冻存技术的结论。另一项临床研究对比玻璃化冰冻卵细胞组与胚胎冻存，结果显示，卵细胞冻存和胚胎冻存种植率、临床妊娠率、累积临床妊娠率、正在进行的妊娠率两组无统计学差异，而自然流产率胚胎冻存组较高，认为：卵细胞玻璃化冻存达到和胚胎冻存相同的婴儿出生率[14]。

对于30岁左右的年轻肿瘤患者或非肿瘤患者女性玻璃化冻存卵细胞存活率较高，可达到临床活产。Chang 等[15]就30～39岁女性卵细胞玻璃化冻存技术的前瞻临床研究中，卵细胞玻璃化冷冻复苏后卵细胞存活率为79.6%，β-人绒毛膜促性腺激素阳性率、临床妊娠率、着床率分别为59%、45.4%、30.1%，总活产出生率为5.9%，结论认为：30～39岁女性玻璃化冻存技术可达到高种植率、妊娠率。Garcia等[16]开展的一项为期5年的多中心、回顾性、观察性研究，比较中位年龄(31.9±5.1)岁肿瘤患者和非肿瘤患者使用玻璃化冻存技术差异，研究表明两组患者玻璃化冷冻卵母细胞存活率、妊娠率无统计学差异，且控制性超促排卵技术具有现实意义。

近几年的卵细胞冻存的病例报道也给我们很好的鼓舞：无性生殖细胞瘤患者通过冻存卵细胞保存生育功能1例病例报告[17]。2016年法国首例化疗前冻存卵细胞玻璃化冻存且成功生育的IV期霍奇金淋巴瘤患者[18]。目前国内尚无肿瘤患者行卵细胞冻存并成功生育的报道。2015年协和医院对22～40岁的原发性乳腺癌患者生育计划与治疗决策进行调查，262例乳腺癌患者中仅2例行胚胎冻存，其余患者均未进行胚胎、卵细胞、卵巢冻存等保持生育措施。中国肿瘤患者，尤其是年轻的肿瘤患者虽然有较高的生育需求和计划，但生育能力保持的现状很不乐观[19]。

3 现存问题分析

3.1 卵细胞冻存安全

虽然美国社会生殖医学不再将卵细胞冻存视为实验，也有利好的数据显示玻璃化卵细胞与新鲜卵细胞相比并没有风险增加，也没有增加先天性畸形的后代数量。然而，这些数据尚不完善，不足以排除风险增加的可能性[20]。冷冻可对卵母细胞纺锤体造成损伤，干扰减数分裂，若为未成熟卵母细胞，需采取冷冻复苏之后培养成熟或者先体外培养成熟达到MⅡ期再冷冻两种方式。Stefanie等[21]通过研究未成熟卵发现，相对于MI期与GV期，体外培养达到MⅡ期后进行冷冻复苏能够获得较高的成熟率，并且优胚率也更高。

卵细胞冻存的短期安全性可以用先天性畸形、不良产科结果来评价，但是长期安全性方面，如婴幼儿长期随访的现有研究较少[22]。2016年发表的卵细胞冻存出生的大样本研究，纳入2005年～2013年向意大利国立卫生院上报的2152名卵子冷冻产生的婴儿，从先天性畸形和胎儿染色体数目异常两个维度分析卵细胞冻存的安全性。2152名卵子冷冻产生的婴儿中先天性畸形发生率为0.9%，这一比例并未高于正常自然分娩婴儿先天性畸形发生率[23]。

然而，对细胞学研究、动物模型的分子基因水平的分析，提示卵细胞玻璃化冷冻改变卵细胞的微丝构象，并对卵细胞亚细胞结构产生一定影响。卵细胞冷冻是否足够安全，尤其卵子冷冻后出生婴儿长期评估的长期大样本研究是亟待解决的问题[24-26]。2015年NEJM杂志上发表的一项研究，更是明确指出30岁女性行卵巢刺激获得卵细胞的短期副作用：卵巢过度刺激综合征、未来潜在的生育影响以及多种妇科恶性疾病的长期副作用[27]。

3.2 卵细胞捐献

30岁左右部分低分化肿瘤患者一般涉及到卵细胞捐献。女性一生共计400多个卵细胞，总体数目少，卵细胞捐献本就存在着一定难度。而每次卵细胞冻存的中位冻存数目为6个，整个捐献周期约为1。5个月，这无疑增加了卵细胞捐献难度[28]。此外，阻止女性捐献卵细胞的情况还有以下3种：首先卵细胞捐献存在并发症风险，包括卵巢过度刺激症、不孕症、手术并发症、激素的副作用、注射疼痛和卵巢囊肿等；其次卵细胞捐献女性主要集中在18～25岁，该年龄段的女性更容易被网络上不真实的捐献信息所迷惑，进而不能捐献；再次，年轻女性不能承受捐献卵细胞的心理负担。

Braga等[29]在对新鲜卵细胞和玻璃化卵细胞的对比研究中发现：玻璃化法冻存卵细胞解冻后行卵母细胞胞浆内单精子注射，胚胎发育能力较新鲜卵细胞低，而移植到“更易接受”的子宫内膜后，妊娠率和植入率却较高[28]。

3.3 卵细胞冻存费用

在欧洲van 等[30]研究，卵细胞冻存每例活产费用为19560，具体花费如下，卵细胞冻存费用(3次)9126，年保存费用40，每IVF周期费用3042，流产费用740[29]。Hirshfeld等[31]注意到卵母细胞冷冻保存每一例活产花费135520美元，并就卵细胞冻存和后续妊娠等过程进行了详细的费用研究：卵细胞冻存费用约26000美元，卵细胞保存的年平均费用为275美元，每进行一次IVF的费用为9547(7,000～15,225)美元。

美国就卵细胞冻存的商业现状对7家“卵子银行”进行横断面研究，7家“卵子银行”采用3种不同的操作模式。各银行建议的冻存卵细胞最低数量为6颗(4～7颗)，每颗卵细胞的费用约为2225(1500～2500)美元，7家“卵子银行”的临床妊娠率差异较大，从暂无临床妊娠数据(2家)到临床妊娠率12.0%，总体临床妊娠率约7.7%[32]。

中国就卵细胞冻存费用尚无明确的文献，1篇关于卵细胞冻存的报道中指出，取卵细胞的手术费用平均人民币2万元左右，冻存卵细胞每年的保存费用为1000～2000元人民币，加之后续治疗费用，费用预计在3万～5万元人民币不等。故卵细胞冻存绝对是需要多次就诊、花费大量时间和经济费用的一项临床行为。

4 展望

在女性肿瘤患者接受放疗、化疗前，对其卵母细胞进行采集，能够保存生育能力，该方式具有干预少、消耗时间短以及不延误下一步治疗等优点，同时不会致使肿瘤细胞扩散，降低复发潜在危险。卵细胞冻存为可行性高的临床高效方式，必须肿瘤科、教育、放射科、法律、妇产科以及社会科学等各个领域工作人员的通力协作。现今，胚胎冻融技术正在日益完善，但由于卵母细胞自身具有特殊结构易产生冷冻创伤，因而卵子冻融技术进展比较缓慢。Völz等[33]指出人类卵细胞冻融技术发展至今开展已30余年，越来越多的冻卵新生儿出生，卵细胞冻存现有数据和冻存技术都为肿瘤患者卵细胞冻存提供了可靠依据。近年来备受争议的生殖细胞基因编辑技术在肿瘤患者卵细胞冻存中能否得到应用，如对肿瘤患者的卵细胞进行基因编辑改变母代肿瘤疾病的肿瘤携带基因，进而改变胚胎的DNA。基因编辑技术尚属未知，但我们仍要看到人类卵细胞冻存的研究和临床应用仍然处于探索阶段，冻存技术有待提高，长期安全性的临床数据有待建立，伦理方面尚需进一步探讨，冻存费用能否降低都是今后未来要面临和解决的问题。

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